《Bioconjugate Chemistry》：组织透明化结合全脑三维成像揭示小分子外用药物NA在脑内分布
筛选药物时，了解药物在大脑中的药代动力学和评估药物向大脑传递的重要性不可忽视。之前的研究已经证明了CAG（启动子）重复序列结合的小分子萘-氮喹诺酮（NA）在由CAG重复序列异常扩增引起的齿状脑-白斑萎缩（DRPLA）和亨廷顿病（HD）小鼠模型中引起CAG重复序列收缩。然而，关于NA在大脑内的分布和药物传递性方面仍存在一些未知。最近，一篇发表于Bioconjugate Chemistry的文章介绍了一种使用组织透明化结合光片荧光显微镜（LSFM）的外部给药小分子的三维全脑成像方法。
文章中的作者设计并合成了一种含有伯胺的alexa594标记的NA衍生物（NA-Alexa594-NH2），通过全脑成像结合组织透明化技术，揭示了NA-Alexa594-NH2在脑内和脑室内的分布情况。通过跟踪药物在脑内分布的时间依赖性变化，研究阐明了鼻内给药NA-Alexa594-NH2通过多条鼻-脑通路进入大脑。
图1 不同给药方式下药物全脑三维分布
一般来说，物质进入大脑的运输受到血脑屏障（BBB）、血脑脊液屏障（CSF）和CSF-脑屏障等屏障的严格控制，以维持大脑的环境稳态。化合物在大脑内的运输取决于其物理化学性质，例如分子量和疏水性等因素。然而，关于NA在大脑内的药物递送性还存在未知。该研究通过使用三种注射给药方法（脑实质、脑室内和鼻内），并进行三维成像观察药物在脑内的分布情况，阐明了外用NA衍生物的脑内分布。
先前对HD小鼠进行CAG重复序列收缩的研究采用的是脑内注射方法，因此作者首先测试了能否通过LSFM检测到透明小鼠脑内注射的NA-Alexa594-NH2的荧光信号。结果显示，在将NA-Alexa594-NH2注入小鼠脑实质后，荧光信号仅在注射周围的左脑半球观察到，表明NA-Alexa594-NH2在注射后立即停留在注射部位周围，并未扩散到整个脑。此外，研究还证实了将NA-Alexa594-NH2注入大脑后，可以通过组织透明化和LSFM的三维全脑成像技术检测到荧光信号。
图2 脑实质给药后NA分布
随后，进一步评估了ICV给药NA-Alexa594-NH2在脑内的分布，ICV给药被用于检测药物对中枢神经系统的直接作用，尤其适用于低可透过性的药物。通过三维全脑成像，在给药后的第0小时和第1天，观察到荧光信号分布遍及整个大脑，包括脑实质和边缘区域。这些结果表明，ICV给药的NA-Alexa594-NH2可能通过脑脊液循环扩散到中枢神经系统，并在给药后1天在整个大脑中积累。此外，还证实了ICV给药后纹状体中NA-Alexa594-NH2荧光信号的积累。
图3 ICV给药后不同时间点NA分布
脑实质内和ICV给药存在高度侵入性的缺点，但同时能够直接将药物输送至中枢神经系统。相比之下，鼻内给药是一种非侵入性的方法，通过多条鼻-脑通路将药物从嗅上皮输送至脑或脑脊液，与ICV给药时NA-Alexa594-NH2在脑内的分布有显著差异。为了探究NA-Alexa594-NH2经鼻-脑通路进入脑内的药物递送性，研究人员对左鼻孔给药后NA-Alexa594-NH2在脑内的分布过程进行了检测。在给药后0小时（即给药后立即固定）以及给药后0.5、1、3、6和24小时进行了3D全脑成像。结果显示，在给药后0小时，可以观察到左、右嗅球和脑血管中NA-Alexa594-NH2的荧光信号，但这些信号在给药后1小时内明显减弱。注射后0小时的脑矢状面图像显示荧光信号在尾侧脑干和吻侧嗅球区域的分布。之前的研究表明，大鼠和食蟹猴接受鼻内给药后，标记蛋白会立即分布在尾侧和吻侧区域，与NA-Alexa594-NH2在脑内的分布类似。此外，NA-Alexa594-NH2的荧光信号未扩散至脑血管外，表明其未穿透血脑屏障。脑切片免疫染色分析显示NA-Alexa594-NH2定位于血管内皮周围。尽管给药后1小时嗅球中的荧光信号消失，但在给药后3和6小时，左侧嗅球中观察到荧光信号的重新积累，即使在给药后1天和1周仍可观察到。鼻到脑的传递机制可能通过多种途径实现，包括细胞外和细胞内运输途径。细胞外转运途径可分为嗅觉和三叉通道，它们分别将鼻内给药物质快速转运到嗅球和脑干。从左鼻给药后，NA-Alexa594-NH2的荧光信号在给药后立即在左右嗅球中积累，表明NA-Alexa594-NH2可能通过细胞外通路到达两个嗅球。
图4 IN给药后不同时间点NA分布
由于脑微血管存在血脑屏障，针对中枢神经系统（CNS）的候选药物难以递送至脑内，因此药物的脑内递送一直是治疗CNS疾病的挑战。许多研究者致力于开发成像技术，以分析感兴趣分子的药代动力学。组织透明化结合LSFM的应用改善了这一困境，对小分子化学药物进行全脑成像不仅有助于揭示药物在脑内的分布情况，还有助于了解药物进入大脑的途径，从而促进对药物在脑内的药代动力学的理解，提高药物的递送性和治疗效果。
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这些光透明方法均可高效完成小鼠、大鼠、猕猴等脑组织的透明化，其中新一代透明方法可在2天内实现小鼠脑的完全透明，达到“隐形”效果，极大提高三维成像深度和成像质量。