《Cell》：组织透明化技术揭示颅骨-脑膜连接结构参与神经系统疾病免疫调节

中枢神经系统（CNS）边界的免疫细胞与中枢神经系统驻留免疫系统之间复杂的互作关系已成为人们深入研究的课题：脑膜的硬脑膜通过颅骨-脑膜连接（SMCs）直接连接到临近的颅骨骨髓，这可以允许免疫细胞通过颅骨骨髓招募至脑膜。

流式细胞术以及scRNA-seq提供了脑膜免疫细胞的细胞类型组成以及分子谱系的研究方法，中枢神经系统边界来源的细胞，在功能上可能不同于相同类型的血液来源细胞以及中枢神经系统边界不同区域的细胞。

目前，关于颅骨骨髓的功能和多维分子数据以及它与其他骨骼的关系甚少，此前仅有文献表明：脑损伤后颅骨内单核细胞和中性粒细胞的流入量高于胫骨，硬脑膜单核细胞和中性粒细胞主要直接来源于颅骨骨髓。

小鼠骨髓的蛋白质组特征研究主要集中在单个细胞类型和骨骼的稳态中，又或使用基于抗体的方法。至于颅骨骨髓，分析则仅限于小流式或大通量细胞计数，因此，目前尚不清楚颅骨骨髓细胞的表达谱系是否与其他骨骼不同，以及不同类型的骨髓是否对脑损伤的反应是否不同。

人类颅骨骨髓和其他骨髓的功能与分子组成的特征更加不明确。目前关于人类骨髓的组学研究数量有限，对不同条件下不同骨髓之间的潜在差异尚不明确。即使在解剖学水平上，尽管microCT提出了人类SMCs的存在，但它们在细胞水平上的详细构象仍难以表述。

近年，慕尼黑亥姆霍茨中心的一支研究团队，对小鼠和人类不同种的骨髓细胞的RNA和蛋白质表达谱系进行分析。

在小鼠中，作者对三种情况下（对照组，大脑中动脉闭塞（MCAo）组以及假手术组）的六种不同骨骼、硬脑膜和大脑的细胞进行了批量scRNA-seq以及蛋白质组学的研究，其结果显示，不同的骨骼具有不同的分子谱、颅顶表现出差异表达基因（DEG）和配体-受体（LR）对的数量最多，并且都主要与迁移和炎症有关。

在对人类的研究中，作者收集了20名死者的颅骨、脊椎骨和骨盆的尸检样本，并对其进行蛋白质组学分析，再次显示了颅骨的一个独特分子谱系。通过对头骨+脑膜+脑的组织样本进行光学透明，作者在细胞水平上标记了SMCs的解剖细节。这些数据提供了颅骨与人类神经系统疾病之间的重要联系。        

为了测试颅骨骨髓参与对脑损伤的反应，作者使用MCAo作为小鼠中风模型。在MCAo模型组中，将小鼠颈部切开，以暴露颈动脉，对大脑中动脉血管进行闭塞，而假手术组中，则造成一个不引起大脑中动脉血管闭塞的损失：

- 在引起中风手术后的2/24/72h后对颅骨进行双光子成像，其结果显示，假手术组与MCAo组的LysM+细胞（主要是髓系细胞）均显著减少（Fig_S1A）。

接下来，作者使用KikGR模型小鼠对颅骨骨髓和大脑中的免疫细胞进行研究：

- 作者使用紫外激光照明将缺血脑区上方的颅骨中，一种光可转换蛋白转换为RFP（Fig_S1C-S1E）。在光转换1h/6h后的同侧大脑中监测到了RFP+的B/T/髓系细胞（Fig_S1C）。   

这表明，损伤后来自颅骨骨髓的免疫细胞被招募至大脑中。

接下来，为了确认颅骨细胞是否有什么不同之处，为此，作者分别对对照组，MCAo组以及假手术组的三个扁平骨（颅顶，肩胛骨和骨盆（髂骨）），两块长状骨（肱骨和股骨）以及一块不规则的骨（胸椎T5级至腰椎L3）进行了scRNA-seq（Fig_1A）:    

- 对骨的各情况下＞10万个细胞的单细胞转录组学研究显示了17个大类以及50个小类的细胞类型（Fig_1B-1D）。

- 作者发现一个细胞大类在骨中特异性丰富表达，因此，脑膜与脑特异性细胞类群被分离出来（Fig_1B）。

- 在检测中发现了大量的中性粒细胞（25%）和红细胞样细胞（30%）以及其他预期的细胞类型（Fig_1E and Fig_S1F）。

- 中性粒细胞群在这两者间明显分离（Fig_1C）。

- 标准细胞类型的比例在不同的骨中均匀分布（Fig_1E,1F,S1G-S1J）。

为了研究细胞数量的变化，作者使用vDISCO对组织进行透明化处理，并对小鼠细胞分辨率级别的成像：

- 结果显示，与对照组相比，中风后的小鼠颅骨骨髓中总细胞数量（碘化丙啶（PI）标记细胞）数量增加（FIG_S3A-S3）。

- 细胞数量的总体增加与活体成像时LysM+细胞的减少形成鲜明的对比。

为了评估每种细胞类的一个骨骼群体基因表达同其他骨骼群体的差异表达有多强，作者进行了主成分回归分析（Fig_2A）：

- 在所有的三种情况下，颅骨的中性粒细胞与其他骨骼群的中性粒细胞分化最大。    

在对照组中，颅骨特有的DEGs分析显示，颅骨髓系细胞与凋亡过程以及细胞程序性死亡的途径调控相关，主要是转录因子、即时早期基因和分类相关基因：    

- 转录因子包括Nr4a1和Nr4a2，参与细胞增殖、凋亡、代谢和T细胞调控，在缺血性卒中后具有抗炎和损伤限制的作用。

- 分类相关的DEGs包括趋化因子和趋化因子受体：Cxcr4、Ccrl2、Ccl4和Cxcl2。

- 颅骨表现出DE促炎和抗炎基因主要在中性粒细胞中：II1b、Ptgs2、和Thbs2。（其中一些也参与细胞粘附和迁移）

在假手术组中，一些基因与对照组差异上调基因（DUGs）相同，如 Nr4a1 和 Egr1，此外还有一些独特的基因，如 Btg2（抗增殖因子）。一些独特的基因，如 Btg2（抗增殖因子）。

通过组织透明化和免疫荧光染色(Fig_2D and 2E)以及RNAscope(Fig_2F)，验证了颅骨中Nr4a的上调。   

通过使用CellPhoneDB研究LR的相互作用，作者确定了骨类型独特的相互作用（Fig_2G）：

- 在这三种情况下，作者发现了一个适用于所有骨骼共有的LR交互模块，相较于对照组，MCAo组的LR对数量增加（对照组1153对，假手术组1163对，MCAo组1382对），在这些独特的交互作用中，颅骨受对照组和MCAo组的影响最多，在假手术组中，椎骨的比例最多。

基因组学分析表明：    

- 在所有情况下，所有骨骼中常见的基因对主要涉及细胞迁移、细胞因子产生和免疫调节，如：Pecam1-Cd17、Cd74-Mif和Lgals9-Cd47。

- 颅骨特异的配体对包括对照组中的Il1b Adrb2 、Ccl4-Ccr5，假手术组中的Ccl4-Cnr2 和MCAo组中的Cxcl2-Dpp4 、Cd28-Cd86。

- 对照组中的LR对的GO分析主要与趋向性、细胞运动和细胞因子产生相关，在假手术组中则是免疫活性相关(Fig_S3F)。

- MCAo组中颅骨特异的LR对则主要与细胞迁移、趋化性或免疫细胞激活有关(Figure S3F)。

总之，颅骨在测试的骨中显示出最多的DUG和LR对，这表明与迁移和验证相关的独特分子谱系可能是从颅骨骨髓到大脑的不同细胞招募的基础。

为了探讨以上发现在人类中的相关性，作者采用了来自7个人类头部的额叶、顶叶和颞叶区的23个头骨+硬脑膜样本，使用组织透明化技术结合光片显微镜成像技术对SMC进行形态观察（Fig_4A and S5），通过免疫荧光染色技术，使用LYZ2标记髓样细胞，使用IBA1标记巨噬细胞（Fig_S5N and S5O）、PI标记细胞核，凝集素标记脉管系统（Fig_4B-4D）。通常，人类的SMC系统穿过硬脑膜，通过蛛网膜颗粒下方的硬膜下空间（Fig_4B）：在对福尔马林固定的石蜡包埋样本（FFPE）进行切片，明场下成像证实了这一结构（Fig_4E）。

通过对500多个SMC量化统计后发现：

- SMC的宽度多为40-90μm（Fig_4F and S5）。

- 一些位于大血管周围的SMC宽度会达到150μm以上(Fig_4C and video S3)。

- 从骨髓腔到SMC的平均最短路径约为3000μm，沿最短路径的平均半径约为37μm（Fig_S5）。

使用颅骨＋硬脑膜的样本进行组织学研究发现：

这表明，SMC管腔内衬有一层成纤维细胞，这可能会增强SMC开始时就已经进行的脑脊液取样。

最后，在对人类头骨+硬脑膜进行电子显微镜扫描（Fig_S5S-S5W），结果显示：

综上，颅骨中的骨髓对于塑造大脑和脑膜中的免疫反应具有重要作用，本文作者以晚期中性粒细胞为例，研究病理状态下，中性粒细胞相关通路是否存在表达差异，在结合组织透明化技术，通过光片显微镜对样本进行三维成像，完整地展示了皮肤脑膜连接（SMCs）的结构特点以及细胞细节。