《Nature communications》：基于全脑c-fos组织透明化三维整体成像揭示单个“记忆印迹”在不同大脑区域分布

“记忆印记”（engram）是在学习过程中大脑网络中发生的持久的物理或化学变化，代表获取的记忆信息。人们认为，记忆是通过这些变化的表达来实现的，被学习激活的神经元群持有记忆印记，而这些神经元的再激活会引起大脑对特定记忆的回忆。记忆先驱Richard Semon早在一个世纪前就提出假设：特定记忆不是存储在大脑某个部位的单个印记集合中，而是存储在一个统一的印记复合物中——即分布在大脑各个区域的印记细胞集合形成的网络连接。早期的情境恐惧记忆研究已经诠释这一概念，但对“特定记忆的统一印记复合体”这一概念的证实仍是一项具有挑战性的研究。

针对上述问题，麻省理工学院皮考尔学习和记忆研究所的一项新研究提供了迄今为止最广泛和最直接的证据，相关成果于2022年发表在《Nature Communications》上。该研究通过组织透明化方法结合三维成像实现全脑神经图谱绘制，证明“记忆印记”的存在，即编码记忆的神经元集合，广泛分布在大脑相关的各区域之间，而不仅仅只是在一个或几个脑区，其中包括一些区域在之前研究并不被关注。

本研究中，研究人员将tdTomato荧光报告小鼠分成三组，分别为留在笼中的小鼠（家笼组），进行情境恐惧条件反射训练并返回其家笼的小鼠（CFC组）、以及在CFC后24小时进行恐惧记忆回忆的小鼠（回忆组）。随后，研究人员对不同组小鼠的大脑进行透明化处理，使用光片照明显微镜对透明全脑进行三维整体成像，并将三维脑图像与标准小鼠脑图谱进行配准，实现脑区自动分割。通过应用基于神经网络的自动细胞计数算法，研究人员以单细胞分辨率检测了整个大脑样本中tdtomato阳性激活细胞分布，绘制出了247个具有显著记忆编码或回忆活动脑区的分布图谱，其中包括大脑皮层、杏仁核、丘脑、纹状体、下丘脑、海马及其各自的分支脑区。与记忆编码相比，记忆回忆激活的神经元较少，但被回忆激活最强烈的大脑区域也是被编码激活最强烈的区域。此外，在所获图谱中，研究人员发现了几个神经元被编码和回忆强烈激活的区域，与海马和杏仁核亚区相比，它们在记忆形成中的作用鲜为人知。

图1. 组织透明化和三维成像分析获取激活神经元脑区分布

随后，研究人员建立“记忆印记指数”，对117个cfos+大脑区域进行排序，预测这些区域极有可能与记忆印记复合体有关。由于人们认为学习激活的印记在记忆检索过程中会被重新激活，因此研究人员进行了全脑印记再激活实验。在第1天，CFC激活的小鼠用tdTomato标记，三天后，这些小鼠接受回忆测试。测试后，使用三维免疫染色技术对小鼠半脑进行cFos免疫荧光标记，并结合组织光透明技术和光片照明显微成像，检测CFC激活的tdTomato阳性神经元和回忆激活的cFos阳性神经元，生成了一个具有高于随机水平的印记再激活的大脑区域的排序列表。这些实验不仅显示在已知的海马和杏仁核区域有显著的印记再激活，而且还显示在许多丘脑、皮质、中脑和脑干结构中有印记再激活。当研究人员将分析识别的大脑区域与这些重新激活的区域进行比较时，发现其中约60%的区域是一致的。这些实验结果表明通过记忆召回可以在全脑范围内重新激活这些神经元集群。最后，研究人员通过光遗传学实验，验证了记忆印记神经元集群，其中许多与海马体或杏仁核的记忆印记有功能联系。总的来说，该研究验证了记忆存储的统一记忆印记复合体假说，首次为高概率记忆区域提供了列表排序，推动未来更多的相关研究。

图2. 情境恐惧条件反射记忆统一印记复合体中组成印记集合的部分列表 

值得一提的是，本研究中组织透明化和全脑免疫染色标记是解决问题的关键技术。近年来组织透明技术快速发展，结合先进的显微成像技术，使完整小鼠脑样本的高通量分析成为可能。目前以立早基因（immediate early gene）表达的形式对学习时激活神经元为目标，绘制“全脑激活图谱”，如cFos，已被广泛应用于胡须刺激、父母行为、足部电击以及恐惧记忆等研究，对cFos表达的检测和分析已为神经科学领域带来许多开创性进展。

佳维斯（武汉）生物医药有限公司拥有成熟的组织光透明和免疫标记技术体系，技术团队经过二十年的技术沉淀和不断创新迭代，成功实现整个组织中cFos蛋白的完整均匀标记（如下图3所示），该技术将为神经科学家们的研究提供新的技术手段。

图3 小鼠全脑cFos神经元免疫荧光整体标记、透明及成像