活体皮肤光透明在生物医学成像中的应用
皮肤是人体最大的器官，也是人体的第一道屏障。皮肤中含有丰富的血管、淋巴管，以及调节体温、感知外界刺激和提供免疫防御的神经，在维持人体正常生理状态方面起着至关重要的作用。当机体发生病变时，皮肤可能受到影响，导致皮肤结构和功能异常，获取皮肤的结构和功能变化能够为皮肤病变的诊断和治疗研究提供帮助。
光学成像技术因其无创、高分辨率、高对比度等优点在皮肤成像中得到了广泛的应用。然而，皮肤是一种混浊的介质，具有复杂的成分和不同的折射率，这限制了光学成像质量。为了实现活体水平皮肤的高分辨光学成像，研究人员发展了多种基于外科手术的皮窗模型。然而，手术建立的皮窗模型不可避免会引起机体局部或系统性的炎症反应，尤其在病理条件下，炎症的响应会进一步加剧，导致无法获取真实微环境下皮肤的结构与功能变化。
近些年发展起来的组织光透明技术，其通过向组织引入特定的化学试剂，使生物组织各成分之间的折射率匹配，让生物组织本身变得透明，从根本上克服了生物组织高散射的问题。目前，离体组织光透明技术已经成为光学成像的重要辅助手段，可用于获取离体组织和器官的高分辨三维整体图像。近年来发展的活体皮肤光透明方法能够有效提升皮肤血管和细胞的光学成像质量，为研究皮肤结构与功能的变化提供了重要的研究手段。活体皮肤光透明的原理如图1a所示。目前活体皮肤光透明技术在小鼠耳朵、背部、足垫部位的皮肤上均展现出了良好的透明能力（图1b）。本文主要介绍活体皮肤光透明技术在光学成像中的应用。
1. 激光散斑/高光谱成像（Laser Speckle Contrast Imaging/Hyperspectral Imaging, LSCI/HSI）
血液微循环信息对于研究血管性病变的发生发展过程具有重要意义，由于具有非接触、无创伤、快速成像等优点，激光散斑/高光谱成像技术非常适用于血流及血管饱和度的观测。如图2所示，活体皮肤光透明技术能够显著提升激光散斑（图3）/高光谱成像的质量，从而提高小鼠皮下血管血流与血氧饱和度信号的分辨能力。
图3. 活体皮肤透明前后白光和激光散斑成像
此外，结合活体皮肤光透明技术，可以实现皮下血管血流动力学变化的动态观测。在光透明皮窗的基础上，可以实时观测小鼠皮下血管血流及血氧饱和度对血管收缩药物去甲肾上腺素（Noradrenaline）的响应过程。研究人员还跟踪观测了不同病程糖尿病小鼠血管响应功能的变化（图4）。结果发现：对于正常小鼠，去甲肾上腺素使动脉和静脉血流和血氧水平在数分钟内下降，然后逐渐恢复到初始水平；然而，在1型糖尿病（T1D）小鼠模型中，随着T1D的进展，血流恢复变得越来越困难，去甲肾上腺素引起的动脉血氧下降减弱。这表明糖尿病可引起血管舒缩功能障碍。在此基础上，研究人员动态监测了不同病程的糖尿病小鼠皮肤/皮层微血管血流血氧在血管舒缩药物作用下的功能响应，定量比较分析了两者之间的差异。结果发现小鼠皮层血管血流与血氧响应异常在糖尿病早期就出现了，而皮肤微血管仅血氧响应异常响应出现较早，血流的响应异常响应在早期完全观察不到，在后期才有所表现。因此，糖尿病诱导的皮肤血管血氧代谢变化有潜力作为糖尿病引起的脑血管功能紊乱的预警指标，这对早期的糖尿病诊断和干预治疗有重要的参考价值。
2. 光声成像（Photoacoustic Imaging, PAI）
光声成像是近些年出现的一种基于激光超声的生物医学成像新方法。它是一种混合成像方式，结合了光学成像的高对比度和基于光谱的特异性以及超声成像的高穿透深度，克服了传统医学成像手段的不足。然而皮肤的高散射特性限制了皮肤血管光声成像的效果。研究人员将活体皮肤光透明试剂注射到小鼠皮下后，对皮下血管进行光声成像。结果表明：在所有检测频率下，光声信号都显著升高，极大地改善了小血管和大血管的可视化，定量分析结果显示皮下血管造影深度增加了3~4倍（图5a）。此外，研究人员还将活体皮肤光透明试剂与超声凝胶混合后涂抹在小鼠皮肤表面，作为耦合剂使用。结果发现在试剂作用后，皮肤略微透明，大、小血管的可视化都得到了改善，并且光声成像深度显著增加，血管造影深度提高1.5~2倍（图5b）。
3. 光学相干层析成像（Optical Coherence Tomography, OCT）
OCT是一种具有非侵入性、高分辨率特性的三维成像系统，其在医学领域特别是眼科发挥着极其重要的作用。与光学显微镜相比，其穿透深度更深；与超声、CT 、MRI等医学影像技术相比，其分辨率更高。由于具有无损伤和高分辨的断层图像获取能力，OCT有望对人类活体组织或器官进行光学活检，即无需切取组织也能获得活体的微细结构信息和组织学分辨率。如图6所示，活体皮肤光透明技术可以极大提高OCT的成像性能。在透明前，皮肤血管只能隐约可见，OCT血管成像严重受限。然而，在皮肤光透明试剂作用后，皮肤变得相对透明，并且可以通过OCT成像清晰观测大血管和微血管结构。此外，血管造影图像的信噪比和血管百分比面积也大大增加。而且在去除皮肤光透明试剂后，皮肤又可以恢复到原始的浑浊状态。
图6. 活体皮肤光透明用于OCT成像获取小鼠皮下血管结构[5]。
4. 双光子显微成像（Two-photon Microscopy）
与其它光学成像技术相比，双光子成像技术具有较高的空间分辨率，可实现细胞与亚细胞分辨水平的结构成像研究，以其大穿深、低光毒性、低光漂白等优点而被广泛应用于活体和活细胞/组织的成像观察。一般来说，双光子成像技术用于皮肤研究时需要配合特定的皮窗，而活体皮肤光透明技术的发展为其应用提供了一种新型的非侵入式的观测思路。如图7所示，活体皮肤光透明技术能够显著提升皮下免疫细胞双光子成像的效果。一方面，双光子成像获取的图像信号强度和信噪比都显著提高；另一方面，活体双光子成像的深度也得到极大提升（2~3倍）。
借助活体皮肤光透明技术，研究人员还研究了糖尿病对小鼠皮肤免疫功能的影响。在糖尿病小鼠足垫诱发延迟型超敏反应（DTH）后，通过双光子成像观察单核/巨噬细胞在不同时间点的响应。结果发现糖尿病小鼠DTH后单核/巨噬细胞的浸润和募集增加，但其运动能力明显减弱，说明单核/巨噬细胞免疫功能异常，并且其功能异常随着糖尿病的进展而进一步增强（图8）。通过体内皮肤光透明提高光学成像深度，可以比较炎症部位周围不同深度的单核/巨噬细胞的运动行为。对于正常小鼠来说，在DTH早期（DTH-4 h）皮肤深层单核/巨噬细胞的迁移距离明显大于浅层，而在DTH晚期（DTH-72 h）则相反，说明不同深度的皮肤免疫反应存在差异。
5. 激光治疗
随着激光技术的出现和迅速发展，激光在医疗中的应用越来越普遍。然而，为了达到最佳的治疗效果，激光的选择是至关重要的。激光波长、脉冲宽度和能量等因素必须根据具体的疾病、状况和病变部位仔细考虑，同样重要的是克服目标区域上方的组织所带来的挑战。散射和吸收会减少到达目标的光通量，防止光聚焦在目标上。虽然增加激光功率可以在一定程度上改善治疗效果，但也会对周围组织造成更大的损伤。而活体皮肤光透明试剂可以极大程度上降低皮肤组织的散射，从而显著提高激光治疗的疗效。
在鲜红斑痣治疗中，多脉冲激光通过凝固病变血管发挥了强大的作用。当活体皮肤光透明应用于大鼠背部皮肤时，与未透明处理相比，达到最终疗效（即目标血管的线状收缩）所需的激光脉冲数减少了约40%（图9a）。此外，活体皮肤光透明也可以与光动力治疗、光热治疗等光诱导疗法结合，用于治疗皮肤深层肿瘤。研究表明：在皮下肿瘤的光热治疗过程中，活体皮肤光透明处理可以降低治疗所需的激光强度，并减少皮肤热损伤；而且在减少副作用的同时可以使更多的光子到达目标肿瘤，从而增强疗效，显著促进肿瘤细胞凋亡，更大程度抑制肿瘤细胞增殖（图9b）。也有研究表明：活体皮肤光透明对纹身去除有积极作用。对色素沉着的皮肤进行光透明处理后，激光照射后色素清除率显著增加，激光纹身去除的效率提高了1.5倍（图9c）。
总结与展望
近年来发展的皮肤光透明技术为活体皮肤结构与功能观测提供了一个非侵入型的光学窗口。随着光透明皮窗的出现，激光散斑成像、高光谱成像、光声成像、OCT成像和非线性显微成像等多种光学成像技术被应用于皮肤及皮下血管、免疫细胞结构和功能的活体观测。借助活体皮肤光透明技术，可以动态观测糖尿病等慢性疾病发展过程中皮肤结构（如胶原纤维含量与分布）、血管功能（血管渗透性、血管响应性）、免疫细胞功能（免疫细胞聚集、运动特性）的变化规律，这为全面理解疾病状态下皮肤结构与功能变化提供了重要手段。不仅如此，颅骨光透明技术也为皮肤靶向光操控提供了非侵入性的窗口，如实现皮下血管的靶向损伤；增强激光治疗皮下肿瘤、鲜红斑痣、黑色素沉着的疗效等。这极大的拓展了皮肤光透明技术的应用场景，有望在多种病理模型及其治疗的研究中发挥作用。
在不久的将来，开发适用于人的高效、安全的活体皮肤光透明方法具有重要意义。同时，考虑到人的年龄、肤色、身体部位的差异，在临床应用中应建立针对婴幼儿的皮肤光透明方法，如用于儿科注射、皮肤镜检查、超声检查等。
佳维斯（武汉）生物医药有限公司科研团队自主研发的活体皮肤光透明试剂盒可用于科研动物皮肤透明，能够在实验动物活体状态下进行皮肤透明化，极大提高活体科研动物皮肤成像深度，无创获得皮肤深层区域细胞、微血管等影像结果，具有透明效果好、安全性高、无副作用、可反复透明的优点。结合双光子成像、激光散斑成像等光学成像技术，为皮肤深层次的诊断和治疗提供了更多的便利。
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