Nature Methods丨突破活体成像瓶颈：活体透明化技术赋能深层组织动态观测

活体组织荧光成像一直是探索生命动态过程的核心手段，但生物组织折射率不均导致的光散射的问题，严重限制了成像深度；现有透明化试剂要么对活细胞有毒性，要么破坏细胞生理功能，无法在保持组织活性的同时实现高效透明化，这成为制约神经科学、发育生物学等领域深入研究的关键瓶颈。

近日，日本九州大学研究团队在《Nature Methods》发表题为《Isotonic and minimally invasive optical clearing media for live cell imaging ex vivo and in vivo》的研究。该研究基于折射率匹配原理，开发出含牛血清白蛋白（BSA）的微创透明化介质SeeDB-Live，通过低渗透压球形聚合物减少光散射，实现了球体、类器官、急性脑切片及小鼠在体大脑的结构与功能成像，且不影响神经元电生理特性和动物行为，拓展了活体荧光成像的深度与模态范围。  

一、细胞与类器官成像：体外模型的高效透明化与功能保留

SeeDB-Live 对多类体外培养模型均展现出极佳透明化效果，且能维持细胞活性与生理功能。在 HeLa/Fucci2 细胞球体中，该介质通过与细胞质折射率（1.363-1.366）精准匹配，使共聚焦成像深度从 100μm 提升至 250μm，深层区域荧光信号亮度显著增强，且每日 4 小时处理不影响球体生长（图 1i、j、k）。对于肠道类器官，SeeDB-Live 处理后肠内分泌细胞的 GCaMP6s 信号在深层区域清晰可见，高钾刺激下仍能保持正常钙响应，证明细胞生理功能未受影响（图 1l、n）。在皮质类器官中，通过 Calblyte-650AM 钙成像，成功捕捉到神经元的自发钙瞬变，验证了其在功能成像中的适用性（图 1o、p）。

图1 用于活体哺乳动物细胞与组织成像的无毒光学透明剂筛选

二、急性脑切片成像：结构解析与电生理功能的双重保障

在急性脑切片中，SeeDB-Live/ACSF 灌注 30 分钟即可实现高效透明化，通过减少组织折射率不均导致的光散射，使共聚焦和双光子显微镜的成像深度翻倍（图 2d、e）。借助双光子成像技术，可清晰可视化185-200μm 深层区域的细胞形态与致密神经纤维网络，解决了切片表面机械损伤导致的成像难题（图 2f、g）。

图2 利用 SeeDB-Live 技术优化急性脑切片的形态学成像效果

膜片钳记录证实，SeeDB-Live 处理后 L5ET 神经元的静息膜电位、动作电位频率等核心电生理参数无显著改变（图 3a、b、c），且嗅球切片中神经元的自发与 NMDA诱发钙电位均保持正常（图 3f、i），实现了结构透明化与功能完整性的统一。

图3 急性脑切片中神经元的电生理记录与钙成像

三、活体小鼠大脑成像：微创条件下的深层动态观测

在小鼠在体实验中，通过颅骨开窗与硬脑膜切开术，SeeDB-Live 可渗透至皮质 500μm 深度，使 600-800μm 处的 L5ET 神经元亮度提升 3 倍，清晰呈现树突及树突棘的精细结构（图 4d、g）。该介质对动物无明显毒性，行为学实验表明，SeeDB-Live 处理后小鼠的跑步机运动、挂线测试表现及进食行为均无显著异常，且大脑组织未出现炎症反应（图 4m、n、o）。

图4 低毒性试剂对小鼠大脑进行活体透明化处理

在功能成像中，V1 区神经元的视觉偏好性、方向选择性指数等参数在处理后保持稳定（图 5c、d、e），嗅球僧帽细胞的兴奋性与抑制性气味响应均可被精准捕捉，实现了在体深层组织的动态功能观测（图 5f、g）。

图5 利用 SeeDB-Live 技术改进神经元活动的活体成像效果 

四、落射荧光电压成像：亚细胞尺度的电压动态捕捉

SeeDB-Live 的出现突破了落射荧光电压成像的深度限制，为亚细胞水平电压信号检测提供了可能。在急性脑切片中，结合高速 CMOS 相机（2kHz），成功记录到僧帽细胞树突中动作电位的反向传播，观察到 1.5ms 的传播延迟，无需信号平均即可实现单轮成像（图 6c、f）。在体实验中，该技术使 120-150μm 深度 L2/3 神经元的自发动作电位得以可靠检测，且在清醒小鼠中捕捉到树突的反向传播动作电位（图 6 j、m）。此外，在嗅球中还实现了肾小球水平的群体电压动态分析，为神经信号编码机制研究提供了新工具。

图6 利用 SeeDB-Live 进行离体及在体表荧光电压成像

总结

该研究开发的SeeDB-Live介质，通过BSA介导的折射率精准匹配，解决了活体组织透明化与生物相容性的核心矛盾。其实现了等渗条件下的微创透明化，既保证了成像深度（体外达250μm、体内达800μm），又完整保留了细胞生理功能与动物行为活性。该技术兼容共聚焦、双光子及落射荧光成像等多种模态，为活组织深层结构探索、神经元功能动态监测等提供了强有力的工具，有望在神经科学、发育生物学等领域推动活体成像技术的广泛应用。