《Nature Method》: 人类大脑类器官的谱系记录

类器官是一种基于3D体外细胞培养系统得到的一类与体内组织器官相类似的组织。这些由体外培养所得的组织可发育分化出较复杂的空间形态，并表现细胞与细胞以及其周遭环境之间的互作关系与空间形态，其本身能够表现出与体内分化的器官组织相似的生理反应。相比于传统的平铺细胞培养模式，3D培养的类器官往往发育分化出具有更多功能的细胞类型，打破以往细胞简单平面接触的联系，形成了具有复杂空间形态的“微器官”。这些“微器官”在模拟体内组织器官发育过程中的生理与病理状态表现极其良好，使得其具备了广阔的应用前景。

来自人类诱导多能干细胞（即类器官）的三维（3D）组织模拟了在初级发育组织中观察到的体内结构和多谱系分化的各个方面。并且，单细胞RNA测序（scRNA-seq）已经被广泛低用于识别类器官中分子上不同的细胞类型，识别不同类型之间的中间体，通过计算分析，可以描绘出细胞发育分化的路径，并以此对细胞进行排序，对细胞的分化潜力研究提供相当大的帮助。然而，这些推断不能直接用于细胞谱系的识别。类器官的自组织过程中，其谱系如何建立，仍是研究谱系问题的难题。

随着基因修饰技术的发展，在CRISPR-Cas9基因组修饰产生瘢痕模式，由独特基因序列转录表达形成特殊条形码标记等方法的结合下，scRNA-seq技术已经可以更好地注释复杂组织和其他细胞分化场景中细胞命运规范和轨迹推断。但仍无法直观地观察到细胞发育分化的全过程。

近年，一篇发表在《Nature Methods》上题为Lineage recording in human cerebral organoids的研究报告，建立了一种基于四维光片显微镜的观察并记录组织和胚胎全面发育动态的方法。长时间高分辨类器官光片显微镜由于对活体细胞最低光毒性，实现了对细胞行为与形态的高时空和高分辨率成像。后续的图像可视化分析可以使对谱系的重建开发更加准确。由此，结合单细胞转录组学与四维光片显微镜，为观察记录并理解iPSC衍生的类器官系统中谱系动力学提供了良好的方法。

基于以上技术的结合，作者建立了一个双通道细胞谱系记录器，其通过对一个初始化的iPSC样本池进行克隆追踪，在不同的时间点进行干预形成特定的诱导瘢痕，从而实现各时点上细胞谱系的记录。作者将此系统命名为iTracer，其既可进行克隆分析，也可探索细胞命运建立的时点，从而避免了多轮标记。

本文使用iTracer对类脑器官区域化的谱系动力学进行研究。免疫组化的结果表明，这些组织中可以形成不同的大脑区域，并且其区域发育的模式某种程度上反应了大脑在体内的发育过程。大脑类器官发育的一个时间过程中的单细胞转录组分析也证实，单个类器官中形成不同的大脑区域，其区域特征同发育中的鼠脑区域图谱相似。

为探索大脑类器官模式和神经发生过程中的谱系和分子特征，且证明本系统与空间转录组学兼容，本文使用4D光片显微镜提供克隆和形态动力学的评估。实验基于CRISPR的基因扰动纳入iTracer记录系统，使类器官发育过程中时点调控的基因丧失功能，提供转录组学和细胞谱系的输出。

作者使用4D光片显微成像技术实时成像观察含有5%iPSCs的类器官，对神经外胚层到神经上皮阶段发育中的类器官谱系动力学及空间分布。本实验所用到的样本，经FUS-mEGFP标记其细胞核，于成像时将样本嵌入成像室中，并同步进行神经诱导培养（图1.a）。使用Viventis Microscopy开发的LS1 Live光片显微镜，成像过程中使用×25物镜，以步进2μm进行成像，连续采样150步，共计300μm，视频以帧率30min进行采集，连续采集200帧，共计约100h，用于跟踪类器官样本的整个发育过程（图1.b）。根据采集图像可见，类器官内部在发育过程中逐渐形成了多个管腔结构，且每个管腔结构均可在三维上进行追踪（图c）。在整个记录时间内，作者对单个细胞核谱系进行追踪，通过扫描成像的图像，对原始细胞及其分裂形成的子细胞进行标记（图1.d），得到其空间分布（L1），并由此得到了该细胞增殖100小时形成的谱系树（图1.e-f）。通过图像可见，在整个追踪记录过程中，L1集中分布在管腔结构的同一区域（图1.g-j）。

图1.大脑类器官发育的长期光片显微镜观察

作者还跟踪了另外三个细胞和，其中L2/L3与L1在相同的管腔结构区，L4则位于类器官组织另一侧的管腔区。在量化了以上各细胞的谱系树后，得到了类器官中所有子细胞的空间分布（图2.a-c）；经过65h的发育分化过程，初代细胞核平均分裂得到了13个后代细胞核，使类器官的形态发育壮大(图2.d)。在空间上，这些细胞的迁移距离有限，仍集中分布在其亲本的管腔结构附近（图2e-f）。

这些结果显示了类器官中细胞克隆形成的空间分布，以及由细胞分裂形成特殊脑区结构中不同谱系的组成。

图2.利用光片显微镜跟踪原子核谱系的空间分布

本文作者建立了新的方法来追踪人类iPSC衍生的类器官的谱系。作者提出一种动态的双通道细胞谱系记录器iTracer，用于人类iPSC衍生的类器官，旨在从初始化的iPSC池中追踪克隆，并使用诱导瘢痕动态追踪谱系。结合具有自发荧光类器官的长期光片显微镜完成了直接谱系跟踪。并且所有这些谱系记录方法，以及开发的计算和数据可视化方法，都可以应用于任何人类ipsc衍生细胞分化以及器官系统的方法。