《Nature》: 组织光透明成像、光遗传、在体电生理技术联用首次揭示心脏和大脑与机体晕厥之间的特殊遗传通路

       昏厥是一种突发性、短暂性、一过性的意识丧失而昏倒，系因一时性，广泛性脑缺血、缺氧引起，并在短时间内自然恢复。昏厥的产生与由迷走神经感觉神经元介导的心脏抑制性反射有关，由于心输出量的明显减少，或心脏瞬时停搏。大循环中周围血管阻力下降，或由于局部脑供血不足所致。当人体站立时，心输出量停止1～2秒钟，就会有头昏无力感，3～4秒钟却可发生意识丧失。然而，目前对于心脏迷走神经感觉神经元的分子特征、解剖结构、生理特性和行为影响仍知之甚少。因此，通过基因分析和解剖学研究心脏感觉通路，可以更好地理解心脏生理学，并揭示其对大脑状态和行为的影响。

近日，一篇发表在国际杂志Nature上题为“Vagal sensory neurons mediate the Bezold–Jarisch reflex and induce syncope”的研究报告中，来自加利福尼亚大学等机构的科学家们通过组织光透明、在体电生理技术及光遗传等技术，研究首次识别出了心脏和大脑之间与机体晕厥之间的特殊遗传通路。

作者首先通过分析单细胞RNA测序数据，确定了NPY2R VSNs与PIEZO2遗传簇的分离，为心脏感觉神经元的遗传标识提供了特异性。为了证明这些神经元对心脏的神经支配，研究者使用AAV.PHP.S-DIO-gCOMET在NPY2R-Cre小鼠的交感神经节中标记感觉神经元，结果显示它们投射到脑干的孤束核和区域后座核。为了克服心脏组织的复杂性，研究者采用了HYBRiD组织透明化方法，并利用高分辨光片显微镜观察到了大量NPY2R VSN纤维在心室壁的分布。研究结果表明，NPY2R VSNs在心脏中存在一对一的映射，主要靶向心室壁，并主导区域后座核的神经支配。研究者观察到两种感觉末梢类型：末梢网和花状喷射，其中73.4%是末梢网。同时，实验证明不同子集的NPY2R VSNs分别投射到心脏、肺和肠道，而这些投射在脑干中呈空间分离。总体而言，这些结果强有力地支持了心脏感觉神经元通过一对一映射方式神经支配不同器官的概念，其中心脏投射的神经元主要影响心室壁，并在区域后座核占主导地位。进一步的实验证明，通过注射不同荧光素的逆行AAV到心脏-肺和心脏-肠道，研究者发现在交感神经节中几乎没有双标记，这证实了不同亚群的NPY2R VSNs对心脏、肺和肠道的分别投射。在脑干中，心脏、肺和肠道的NPY2R VSN终端呈空间分离，尤其是区域后座核主要接收来自心脏VSNs的神经支配，而孤束核则被心脏、肺和肠道VSNs同时标记。这些结果进一步证实了心脏感觉神经元在神经系统中的高度特异性，以及它们通过不同的亚群对心脏及其他器官进行调控。

以往对心脏感觉神经元操控对行为的影响的研究相对不足。考虑到脑干中存在心室、肺和肠道迷走末梢的空间组织，作者利用光遗传技术，在NPY2R-ChR2小鼠的AP上放置光纤，认为其将是刺激主要是心室末梢的有效策略。这种方法不仅能够探索心室VSNs对心血管生理的影响，还能在自由行动的清醒动物中研究其对行为的影响（迷走NPY2R到AP的刺激，即vagal NPY2R to AP stimulation，简称vNAS）。vNAS数秒内，小鼠突然倒地并变得不动。这种反应在光纤位置不当或对照组小鼠中未观察到。镇痛剂无效，排除了疼痛反应可能导致此效应的可能性。为深入了解这一表型，研究者试图在自由活动的小鼠中记录vNAS期间的脑活动，并通过同时记录脑电图（EEG）来开发一种无偏的电生理标志。通过记录小鼠的脑电图，发现在vNAS期间出现了明显的脑电波功率降低，这与人类晕厥时的脑电图变化相符。因此，研究者认为vNAS可能导致晕厥，并提出在8-100 Hz范围内脑电波功率下降的50%潜伏期是晕厥发作的合理指标。这项研究为心脏感觉神经元在晕厥中的作用提供了新的洞察。通过刺激主要位于心室的VSNs，研究者成功地诱发了小鼠的晕厥现象，并且通过脑电图监测提供了客观的电生理标志。与典型的疼痛反应不同，使用镇痛剂并不能阻止这种晕厥反应，暗示这一现象可能与疼痛无关。这一结果为深入探究心脏感觉神经元在生理和病理状态下的影响提供了直观的实验模型。

图1 心脏-大脑遗传和解剖学联系

接下来，作者利用高分辨率超声波成像与光遗传学结合研究vNAS对心血管功能的生理效应。该方法使研究者不仅能够实时观察心脏的不同视图，还能在遗传学上操纵VSNs并量化心血管参数，包括心率、心输出量、射血分数等。研究结果表明，vNAS使心跳停滞，伴随着心输出量、射血分数、升主动脉直径和主动脉瓣峰值血流速度的显著降低。观察到左室体积、面积和主动脉加速时间（达到主动脉峰值血流的时间）的增加。但是，心搏量、短缩分数和其他心血管参数未受影响，突显了操纵的特异性。此外，光刺激导致血压的迅速时间锁定变化和呼吸的变化。较低频率的刺激没有引起明显的效应。此外，体温未发生变化，这表明主要受影响的是心血管参数。在自由行为的小鼠中也观察到心率下降。总的来说，vNAS导致心动过缓、低血压和呼吸率降低，这与人类晕厥时报道的生理变化一致。此外，这三重反应是BJR的标志，长期以来一直被认为是由心室VSNs引起的。由于vNAS主要激活心室感觉纤维，我们推测NPY2R VSNs可能是BJR的基质，而BJR也被认为是晕厥的触发因素。从概念上讲，这些发现与NPY2R VSNs与调节压力感受器的PIEZO2 VSNs有所不同的事实相结合，可能表明在心脏系统的框架中存在各种反射弧的基因分离通路。

图2 vNAS抑制心血管功能

  作者又通过在体电生理技术和红外摄像机捕捉了面部和眼部运动，来量化vNAS引起的晕厥期间的神经和行为状态。研究者发现在LFPs中存在8–100 Hz频带功率的显著下降，这表明了广泛的脑电信号抑制。与此相似，瞳孔动态和眼动作为晕厥的生理标志，进一步支持了实验模型的有效性，与人类晕厥的相似之处。在这些实验中，LFP功率下降和眼球滚动的潜伏期相一致，强调了这两个度量对于描述晕厥过程的一致性。此外，通过神经电极记录的神经元射频数据揭示了在晕厥开始时神经活动的显著抑制。这一抑制效应在大脑广泛区域内都得到了确认，为研究者提供了一个全面的视角，使他们能够了解vNAS诱导的晕厥如何影响整个神经系统的活动。这种抑制与患者临床病例中EEG信号“平坦化”的观察相吻合，为进一步理解晕厥的神经机制提供了实验支持。

图3 vNAS 触发的晕厥与大脑活动的广泛抑制有关

     在这项研究中，作者鉴定了一个在心脏–大脑界面上具有遗传定义的神经通路，它重新表现了人类晕厥的许多行为表型（晕倒、瞳孔扩张、眼球滚动和运动张力丧失）。NPY2R VSNs通过花束和末梢网末端与心室壁相连。值得注意的是，这些心室VSNs不仅投射到标准的NTS，而且还投射到AP。刺激这些神经元（vNAS）导致晕厥和相关的心血管变化，包括心动过缓、低血压、脑血流灌注不足和呼吸减少。这些生理变化是BJR的标志，它在150多年前首次被描述，并被假设是由主要位于心室的迷走传入c-纤维介导并触发晕厥的。由于NPY2R VSNs是非髓鞘化的c-纤维，它们的消融显著抑制了BJR，这篇文章的实验证实了这两个假设。由此可得，NPY2R VSNs可能是导致晕厥的重要原因。这一研究深入探讨了在晕厥期间神经活动和行为之间的关系，为理解晕厥的神经机制和寻找潜在治疗目标提供了新的视角。