客户文章【Nature Commun】 - 组织透明化技术揭示了吗啡致便秘的脑-肠神经环路关键机制
阿片类镇痛药是临床疼痛管理的核心药物，但长期使用引发的便秘等胃肠道副作用发生率高达40%-80%，严重影响患者生活质量。当前外周μ-阿片受体拮抗剂（PAMORAs）治疗有效率仅约50%，提示中枢神经系统可能参与调控该病理过程。然而，脑-肠轴在阿片类药物诱导便秘中的具体神经环路机制尚不明确，缺乏细胞特异性的功能解析，成为制约新型治疗策略开发的关键瓶颈。
近日，中国科学技术大学曹鹏教授团队在《Nature Communications》发表题为《A brain-to-small intestine circuit mediates morphine-induced constipation in male mice》的研究论文。该研究结合FDISCO组织透明化、病毒示踪、在体钙成像、光遗传学等技术，揭示吗啡诱导便秘的神经环路，为治疗该副作用提供了新靶点。
吗啡通过抑制肠动力诱导小鼠便秘模型建立
研究通过腹腔注射不同剂量吗啡（3mg/kg、6mg/kg、10mg/kg）构建C57小鼠便秘模型，发现10mg/kg剂量可显著降低粪便产量（减少78%）、粪便含水量及小肠转运速率，且不影响小鼠摄食饮水。采用应变片记录技术实时监测肠道蠕动，证实吗啡可降低小肠和结肠蠕动频率、增加振幅，明确肠道动力抑制是吗啡致便秘的核心病理基础，为后续机制研究奠定了稳定的动物模型。
图1 吗啡诱导的小鼠便秘模型
DMVᴬᶜʰ神经元直接支配小肠并调控肠动力
利用逆行示踪技术（荧光金注射、逆行AAV病毒）结合免疫荧光染色，证实DMV区域约95%的胆碱乙酰转移酶（ChAT）阳性神经元可直接投射至小肠。利用FDISCO组织透明化方法对小肠进行透明化三维成像，清晰可视化DMVᴬᶜʰ神经元纤维在小肠肌层的密集分布，该技术凭借优异的荧光保留能力和三维成像优势，为神经环路的解剖学验证提供了直观证据。光遗传学激活小肠壁的DMVᴬᶜʰ神经纤维，可显著逆转吗啡诱导的小肠动力抑制，证实该神经元群体对小肠动力的正向调控作用。
图2 DMVᴬᶜʰ神经元直接支配小肠并调控肠动力
吗啡抑制DMVᴬᶜʰ神经元活性是便秘关键环节
通过在体钙成像和脑片膜片钳记录，发现吗啡处理后小肠投射型DMVᴬᶜʰ神经元的自发钙瞬变频率和放电活性显著降低。化学遗传学激活该类神经元可改善吗啡诱导的粪便产量减少、小肠转运减慢等便秘表型，而抑制其活性则在正常小鼠中模拟出便秘症状，明确DMVᴬᶜʰ神经元低活性是吗啡致便秘的必要条件。进一步免疫荧光检测显示，DMV区域的μ-阿片受体（MOR）主要定位于VgluT2阳性的兴奋性神经末梢，提示上游谷氨酸能神经元可能通过MOR介导吗啡的抑制效应。
图3 DMVᴬᶜʰ神经元活性下降是吗啡诱导便秘关键环节
PVN¹ᴳˡᵘ→DMVᴬᶜʰ→小肠环路的鉴定与功能验证
采用逆行单突触狂犬病病毒示踪技术，发现PVN是DMVᴬᶜʰ神经元的主要上游脑区，且PVN中92%的DMV投射神经元为谷氨酸能神经元。通过顺行病毒示踪结合电生理记录，证实PVN¹ᴳˡᵘ神经元可通过AMPA受体直接兴奋DMVᴬᶜʰ神经元。吗啡可显著抑制PVN¹ᴳˡᵘ神经元的钙活动和放电频率，而直接向PVN注射吗啡可诱导便秘，注射MOR拮抗剂纳洛酮则可逆转该效应，证实PVN¹ᴳˡᵘ神经元是吗啡作用的中枢靶点。
图4 PVN¹ᴳˡᵘ→DMVᴬᶜʰ→小肠环路的鉴定与功能验证
MOR敲低与环路调控的治疗潜力验证
在VgluT2-Cre小鼠中特异性敲低PVN¹ᴳˡᵘ神经元的MOR，可显著恢复吗啡处理后PVN¹ᴳˡᵘ神经元的活性，改善粪便产量、小肠转运速率和肠动力，证实PVN¹ᴳˡᵘ神经元上的MOR介导了吗啡对该环路的抑制。联合使用外周MOR拮抗剂纳洛酮乙二醇醚与PVN¹ᴳˡᵘ神经元MOR敲低，便秘缓解效果优于单一干预，提示中枢和外周MOR通路共同参与吗啡致便秘的调控。此外，光遗传学或化学遗传学激活PVN¹ᴳˡᵘ→DMVᴬᶜʰ环路可有效逆转吗啡诱导的便秘表型。
图5 MOR敲低改善吗啡诱导的便秘
图6 激活PVN¹ᴳˡᵘ→DMVᴬᶜʰ环路可有效逆转吗啡诱导的便秘
总结
该研究首次阐明了吗啡致便秘的中枢神经环路机制，突破了以往仅关注外周肠神经系统的研究局限。通过组织透明化、病毒示踪等技术的创新应用，清晰解析了脑-小肠神经环路的解剖学连接与功能调控关系，揭示了MOR介导的中枢环路抑制在便秘发生中的核心作用。这一发现不仅解释了现有外周拮抗剂治疗效果有限的原因，更为开发靶向外周+中枢神经环路的新型治疗策略提供了重要理论依据，为临床解决阿片类药物副作用开辟了新方向。
研究应用FDISCO组织透明化技术结合病毒示踪与在体电生理、光/化学遗传，并搭配光片显微镜成像，成功实现了DMVᴬᶜʰ神经元纤维在小鼠小肠肌层的高分辨率三维可视化。借助这一技术，研究直观呈现DMVᴬᶜʰ神经元纤维的密集分布特征，精准还原其分支形态、投射路径及与肠道平滑肌的空间毗邻关系。它完美解决了传统二维切片难以捕捉神经环路三维连接的局限，为“DMVᴬᶜʰ神经元直接支配小肠”这一核心解剖学结论提供了无可替代的直观证据，显著提升了神经环路验证的可信度与准确性。