《Nature Biomedical Engineering》：数字病理的未来：透明化3D病理技术的崛起和应用展望

近年来，随着医学影像学的飞速发展，病理学领域也迎来了变革的机遇。传统的2D病理图像分析逐渐迈向了更为先进的非破坏性3D病理技术，这一新兴技术不仅提升了肿瘤诊断的精确性，也为精准医疗和临床决策提供了全新的视角。一篇发表于Nature Biomedical Engineering的文章详细综述了非破坏性3D病理技术的现状、挑战及其未来发展方向，以便读者迅速了解并使用该新兴技术。

一、非破坏性3D病理技术的现状与进展

近年来，3D病理学技术凭借其能够捕捉肿瘤组织立体信息的优势，成为病理学的研究热点。传统病理学方法依赖于薄切片的2D图像，这种方法固然有其优势，但也存在显著的局限性，尤其在肿瘤微环境的分析中，2D切片无法全面展现肿瘤组织的三维结构。而3D病理技术则能够对肿瘤的形态、免疫微环境、细胞分布等复杂特征进行深入分析，极大地提升了诊断精度和临床应用潜力。

3D病理成像技术，如光片显微镜和光学切片显微镜，已经能够实现对大体积组织样本的扫描，并在不破坏组织结构的前提下提供细致的三维重建。这一技术使得病理学家能够以全新的方式审视组织样本，提高了对病变区域的识别率和诊断准确性。除此之外，3D无损成像技术使得宝贵的活检样本可以用于后续的分子检测，不会破坏样本，且相较于传统方法，3D病理能够简化病理实验室的操作流程，并且具有潜在的成本优势（图1）。

图1 常规病理学与非破坏性3D病理学

作者还通过三个例子简述了3D病理学的优势（图2）。第一，3D病理技术在处理复杂结构（如血管和腺体的分支网络）中的优势。在病理学中，许多疾病进展会破坏这些复杂的结构，而传统的2D切片分析常常无法准确反映这些变化。例如，前列腺癌的Gleason评分是基于腺体的结构进行的，而在2D切片中，一些看似不规则的腺体（Gleason模式4）可能仅仅是一个切面，实际它可能是一个正常结构的腺体（Gleason模式3）。因此，使用3D病理技术可以更准确地评估腺体的真实形态，将病理评分从2D判断的Gleason评分3+4=7降低到3+3=6。第二，关于肿瘤-免疫微环境中细胞的分布。在肿瘤微环境中，免疫细胞与癌细胞的空间关系和相互作用对治疗效果和预后有重要影响。例如，PD-1阳性的细胞毒性T细胞和PD-L1阳性的癌细胞之间的接近度，或免疫抑制性中性粒细胞和细胞毒性T细胞的平衡，都可以通过3D成像技术得到更好的定量和描述。相比之下，传统的2D切片方法往往不能充分展示这种复杂的细胞分布，尤其是在疾病的空间异质性较强的情况下。第三，对于稀有细胞（如肿瘤前体细胞、最小残留病灶以及侵入淋巴血管网络并转移的肿瘤亚克隆）的识别，传统的薄切片通常难以识别这些稀有细胞，而这些细胞可能在疾病的发生、耐药性以及转移中发挥关键作用。3D成像技术能够更好地捕捉和分析这些稀有细胞事件，从而帮助识别肿瘤的起始细胞（即癌症干细胞），这在癌症进展、耐药性和复发等方面具有重要的临床意义。

图2  3D病理学优于2D病理学的示例

二、3D病理的独特挑战

尽管3D病理技术有着显著的优势，但其应用和普及仍面临着诸多挑战。首先是数据处理和存储的挑战。与传统的2D病理图像相比，3D病理图像数据量巨大，如何高效处理和存储这些海量数据，是当前技术面临的核心问题。

此外，3D病理的标注和训练也存在挑战。由于3D病理数据具有更高的维度，传统的2D标注工具和方法无法直接适用。因此，开发适用于3D病理图像的标注和分析工具，尤其是能自动化或半自动化的标注软件，成为研究的重要方向。

三、3D病理的关键步骤与革新

3D病理技术中的关键步骤有：组织透明化，3D光学成像，3D图像处理以及3D数据分析等。其中，组织透明化是3D病理的基础，组织透明化技术可以提升样本的成像深度及成像质量（降低背景干扰），组织透明化的基本原理是通过使组织内的折射率均匀化，通常通过脱水并用折射率较高的溶剂替代水分（折射率约为1.33），使其更匹配组织中的其他成分（如蛋白质和脂质），但不同的透明方法对于荧光标记的方法有不同的兼容性，在透明过程中，应根据荧光标记方法和样本的类别，恰当选择其透明方案。现在，组织透明化和标记技术在无损3D病理中的应用，已经从基础研究逐渐过渡到临床应用。随着透明化技术的进一步优化和新型组织保存方法的发展，未来这些技术有望提高组织样本的保存质量，推动基因组学、转录组学与3D病理的结合，为精准医疗提供更加高效、精确的决策支持。

3D成像技术常见的分为破坏性3D显微技术和无损性3D显微技术（图3）。其中破坏性3D显微技术早期的研究依赖于破坏性串联切片技术，这些技术需要大量的费用和劳动力来对大量切片组织进行成像，并随后进行3D重建。随着技术的发展，一些自动化的串联切片方法，如刀刃扫描（KESM）和微光学切片断层扫描（MOST），显著提高了工作通量，并已商业化应用于提供3D病理数据，但这些方法仍然会破坏组织样本，并引入切片伪影。在无损3D显微成像技术中成像设备主要以共聚焦显微镜、多光子显微镜及光片显微镜为主。虽然共聚焦和多光子显微镜可提供完美的对比度（即拒绝背景）和空间分辨率，但在实际应用中仍存在一些挑战需要克服。例如，共聚焦和非线性显微镜通常以逐点方式生成图像，这需要在所有三个维度上进行空间扫描以创建体积图像。这往往会增加机械复杂性，并且通常很慢。因此共聚焦及多光子显微镜更适用于小样本或对精度要求更高的样本成像。在过去十年中，光片显微镜，也称为选择性平面照明显微镜 （SPIM），已成为对相对透明标本进行快速 3D 荧光显微镜检查的首选技术。光片显微镜采用细的激发光束垂直于探测轴照射样本，从而仅激发样本中感兴趣的局部焦平面（“光学切片”）。光片系统利用高灵敏度且快速的sCMOS探测器阵列，从样本中获取2D图像，通过扫描样本（或光片）可以迅速生成3D数据集。光片显微镜的一个显著特点是其高效的几何结构，仅在探测平面内激发荧光，因而相较于其他3D显微技术，显著减少了光漂白和光损伤。因此，光片显微镜被称为“温和”的3D显微技术。

图3  3D 病理成像方法的比较

3D图像处理部分主要包括：图像的拼接、数据压缩以及可视化处理。图像拼接是图像处理的第一步，需要将成像获得的大量2D图像运用Imaris等软件将其无缝拼接成体积数据集。目前，基于相机的3D显微技术（包括光片显微镜）采用的是16位sCMOS相机，生成的每秒数据量约为800 MB，为防止数据量过大，可通过窗口化数据的动态范围，去除低端噪声和未使用的像素电容（高端），可以实现相当高的“无损”压缩。最后，根据实际需求的不同，可形成不同的可视化效果，例如体积渲染或2D横截面视图，便于对病理结果的审查判断（图4）。

图 4   临床标本的无损 3D 病理图示例

四、跨学科协作与未来发展

3D病理技术不仅限于病理学领域，它与基因组学、放射学等其他学科的结合，能够为精准医学的发展提供更为全面的支持。通过跨学科的数据整合与协作，3D病理将成为精准医疗和个性化治疗的重要工具。例如，将3D病理图像与基因组数据、影像学数据进行联合分析，能够为肿瘤的早期筛查、预后评估、治疗反应预测提供更加全面的数据支持。随着数据处理能力的提升和人工智能技术的加入，未来的病理诊断将更加智能化，推动病理学向全面数字化和高效化的方向发展。

五、总结与展望

总的来说，3D病理作为一种前沿技术，虽然目前仍面临着数据处理、技术标准化等挑战，但随着技术的进步和临床验证的不断推进，3D病理无疑将成为未来病理学诊断的重要组成部分。非破坏性3D病理技术为肿瘤的精准诊断、免疫治疗反应预测、以及临床决策提供了巨大的潜力。通过与基因组学、放射学等其他学科的深度整合，3D病理将为精准医疗和个性化治疗的发展开辟新的天地。