「客户文章」Nature Ecology & Evolution - 组织透明化三维成像揭示脊椎动物肝脏发育的重要基因
器官的进化推动了物种的进化，尤其是像肝脏这样的复杂器官的出现，使脊椎动物成为顶级捕食者。然而，推动这种器官进化的遗传机制仍然不明确。进化发育生物学（evo-devo）长期以来认为形态的重大变化主要依赖于调控网络的重塑，但这一观点受到新基因起源等角度的挑战。此前，有研究提出文昌鱼的肝盲囊可能是脊椎动物肝脏的同源器官，但这一假说的准确性及其背后的遗传机制尚不明朗。
2024年8月16日，西北工业大学王堃教授团队在Nature Ecology & Evolution上发表了题为“Single-cell analysis of the amphioxus hepatic caecum and vertebrate liver reveals genetic mechanisms of vertebrate liver evolution”研究论文，该研究通过体内和体外分析，结合多种技术手段，如单细胞RNA测序、CRISPR-Cas9、组织透明化成像等，研究了脊椎动物肝脏的起源和进化，揭示了脊椎动物肝脏起源和功能创新的遗传机制。
作者首先比较了具有代表性的脊椎动物的肝脏结构和文昌鱼的肝盲囊，发现二者在细胞组成上有显著的相似性，支持了两者具有共同进化起源的观点。接着，作者生成了来自五种脊椎动物的单细胞和单核RNA测序数据，并结合了人类肝脏的RNA测序数据，覆盖了六个类群（包括圆口类、软骨鱼类、辐鳍鱼类、肉鳍鱼类、两栖类和哺乳类），并加入了文昌鱼的肝盲囊数据进行比较。作者还分析了来自19种脊椎动物的657个RNA测序样本。最终，研究整合了来自七种不同谱系的258,736个高质量的单细胞/核数据绘制了脊椎动物肝脏与文昌鱼肝盲肠的单细胞图谱 （图1b-d）。 图1 脊椎动物肝脏和文昌鱼肝盲肠的结构和scRNA/snRNA-seq分析 作者为了进一步研究脊椎动物肝脏的进化过程，特别是在经过全基因组重复（WGD）事件对脊椎动物肝脏的影响，作者通过对文昌鱼和脊椎动物的高变基因（HVGs）和差异表达基因（DEGs）进行了基因本体（GO）富集分析，以探讨两者功能上的差异。发现文昌鱼的肝盲囊表现出较少的显著富集的GO功能术语，反观脊椎动物的肝脏展示了更多复杂的生物功能，如代谢、免疫反应和血液凝固（图2a）。接下来，为了理解脊椎动物肝脏和文昌鱼肝盲囊的功能差异，研究追踪了脊椎动物共享HVGs的进化历史，特别关注从全基因组重复（WGD）中产生的基因拷贝（称为ohnologues）。发现在脊椎动物中，HVGs中有41%的基因是从全基因组重复事件中产生的ohnologues，而在整个脊椎动物基因组中这一比例为29%。这些ohnologues有更高的几率在脊椎动物中具有多个拷贝，并发挥新功能（图2b）。作者还通过ATAC-seq对非洲牛蛙、东洋溪灯鱼及人类肝脏进行染色质可及性分析，探索新顺式调控元件对基因表达的影响。在研究结果中，发现了脊椎动物肝脏新的顺式调控元件，可能调控基因sorl1的表达，该基因与肝脏脂代谢相关。因此，实验结果表明，全基因组重复（WGD）对脊椎动物肝脏的进化具有深远的影响。WGD衍生的基因不仅增加了基因的数量，还扩展了它们的功能，促进了肝脏复杂性的进化。同时，顺式调控元件的进化也对肝脏的功能调控起到了重要作用（图2c-d）。 图2 两轮全基因组复制对脊椎动物肝脏进化的影响 图3 脊椎动物肝脏和文昌鱼盲肠中脊索动物内皮细胞的多样性和基因表达谱 经作者研究发现肝窦状内皮细胞（LSECs）只出现在脊椎动物中，而在文昌鱼肝盲肠中并不存在，但文昌鱼肝盲囊中存在与脊椎动物肝脏相似的内皮细胞亚群，因此说明二者具有同源性（图3a-c）。LSECs 的出现是脊椎动物肝脏复杂化的重要里程碑，研究该细胞的分化过程十分重要。通过差异表达基因分析（DEGs）发现LSECs中有9 个特异性表达基因（如 flt4、kdr、lyve1 等），这些基因在脊椎动物的肝脏复杂化过程中可能经历了新功能（图3d-e）。既往研究表明，对于小鼠胚胎发育过程中LSECs的分化至关重要的基因有三个，分别是 flt4、kdr、lyve1，而有研究表明敲除lyve1对于小鼠肝脏的影响很微弱，因此作者主要研究了flt4和kdr两个基因（图4a-b），并从器官整体水平评估flt4和kdr对肝脏结构发育的影响。 图4 Kdr和Flt4敲除对小鼠肝窦内皮细胞的影响 运用组织器官整体免疫标记技术对完整肝脏唇叶内lyve1靶点进行荧光标记，并结合组织透明化和光片显微镜成像(图5)，获取肝脏唇叶的lyve1+阳性结构，从三维层面比较了野生型小鼠和分别敲除flt4与kdr基因的小鼠，发现敲除flt4与kdr基因的小鼠的肝窦状内皮细胞（LSECs）大量缺失，而在野生型小鼠中，LSECs 的分布则更为连续和广泛。 图5 佳维斯生物助力小鼠肝脏的整体荧光标记及透明化 而且在免疫荧光和免疫组化分析显示也与之类似，Kdr-/+ 和 Flt4-/+ 小鼠的 LSECs 标记物（如 LYVE1、KDR 和 CD32B）显著减少，但血管内皮细胞的标记物 CD34 和 CD31 没有显著变化（图6）。因此表明，flt4与kdr两个基因在维持肝窦状内皮细胞的结构和功能中具有关键作用。 图6 Kdr和Flt4基因敲除小鼠的表型 在此之外，作者又对肝脏的其他功能的进化过程进行了推演与分析。综上所述，文昌鱼的肝盲囊与脊椎动物的肝脏是同源器官。通过两轮全基因组复制（WGD）产生的ohnologue基因极大地推动了脊椎动物肝脏的功能复杂性。其中，kdr和ft4两个ohnologue基因在肝窦内皮细胞的发育中发挥了重要作用。此外，肝脏相关功能（如凝血和胆汁生成）是逐步演化的，基因重复在这一过程中起到了关键作用。研究还重建了脊椎动物进化过程中血红素解毒功能从肝脏转移到脾脏的遗传足迹。
