对于中枢神经系统（CNS）损伤，目前存在多种治疗手段，如激活潜在的生长因子可以以促使神经元再生。同时，将未成熟的神经元干细胞移植到完全的脊髓损伤（SCI）病变中，也可以吸引宿主神经元进入病变并将其轴突延伸到病变外，从而在CNS中广泛生长。然而，尽管通过这些及其他相关方法已经实现了广泛的轴突再生，但功能恢复的重复性仍然难以实现，这意味着存在尚未确定恢复神经功能所必需的机制。对于这些现象存在一系列问题，如：是否需要针对特定神经元并再生这些神经元的轴突，不仅简单地跨过病变区域，而且还需要引导它们到达特定的目标区域，才能实现功能恢复呢？
为了解决这个问题，一篇发表在science上文章研究了脊髓中的神经元亚群，这些亚群可以通过在严重但不完全的 SCI 后中继脊髓上指令来恢复行走。研究人员提出，再生那些在SCI后恢复过程中起关键作用的神经元亚群的轴突，使其仅简单地在病变再生延伸，这种方法可能无法改善功能恢复。然而，如果吸引和引导这些神经元的轴突到达其远端的目标区域，就可以实现行走能力的显著恢复。
本文主要研究了脊髓损伤（SCI）后神经元再生以及恢复神经功能的方法。研究人员发现，虽然可以通过再生神经元来修复SCI，但要实现强大的功能恢复仍然具有挑战性。研究人员提出，恢复神经功能可能需要将特定神经元亚群的轴突定向引导到其自然的目标区域。研究人员使用投射特异性及比较单核RNA测序技术，以确定哪些神经元亚群在SCI后可以恢复行走，并利用组织透明化三维成像技术观察神经轴突三维走势变化。研究结果表明，将这些神经元的断端引导到其自然的目标区域，可以显著恢复SCI后的行走能力，而仅仅在损伤区域再生轴突则没有效果。因此，恢复特征神经元的自然投射是旨在恢复失去的神经功能所必需的一部分。
1. 确定参与自然恢复的神经元的特征
在单侧半切（Brown-Séquard综合征）手术中，这些神经元失去了产生行走所需的脑部以上级输入。然而，人类和动物模型在经历这些损伤后仍然可以恢复双侧行走。一些以前的研究表明，在这种情况下，位于中胸段脊髓的这些神经元可以传递脑部以上的命令，绕过侧半切，从而恢复行走。即使在时间上和空间上分离，对侧或双侧半切病变，这些神经元仍然可以传递足够的脑部以上级输入，以恢复双侧行走。然而，在胸髓对这些神经元进行消融后，在没有损伤的情况下，行走能力不会改变，但会消除单侧或双侧半切后观察到的自然恢复行走的现象。因此，作者旨在解析这种自然恢复背后的神经元亚群的分子和结构特性。
为了确定具有向脊髓投射的神经元亚群，作者在未受伤的鼠的脊髓中注射了重组腺相关病毒，这将具有直接向脊髓投射的神经元核标记在整个中枢神经系统中，包括中胸段脊髓中的潜在中继神经元（图1A），并使得荧光激活的核子分离与单核细胞RNA测序（snRNA-seq）相结合，从而可以对投射特异性神经元亚群进行研究。
图1
接下来作者使用snRNA-seq对中胸段脊髓进行表征，对这些神经元进行了二轮聚类，识别出了28个表达典型标记基因的子群体（图2B）。分类将神经元划分为基本类别，包括运动感觉、局部长程、兴奋抑制子群体（图3 D）。105个eGFPON神经元主要位于表达Vsx2标记和长程投射神经元标记Zfhx3 Z-组神经元的胸髓神经元的一个单一的腹侧神经元亚群（Hoxa7），作者将其命名为脊髓（SC）Vsx2::Hoxa7→lumbar neurons（图2C）。
图2
图3
考虑到胸髓神经元在SCI后仅对行走变得至关重要，作者检查了自然恢复后SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰髓神经元是否发生了转录变化。比较了恢复行走的未受伤小鼠和经过时间空间分离的侧半切SCI小鼠的神经元核（图4，D，E和F）以及恢复行走的恢复期小鼠的神经元核（图4，D，E和F）。
图4
综上所述，研究结果表明，SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰髓神经元在自然恢复后对行走的产生起着重要作用。因此，作者推测这些神经元必须具备与行走后瘫痪恢复所需的连接体特征。2. 胸部中继神经元的连接组特征
为了确定神经元亚群是否具有这种投射组，同时其转录表型是否与之前优先考虑的神经元亚群一致（图5G），作者在Vsx2Cre小鼠脊髓中采用免疫荧光结合病毒注射的方式，结合组织透明化技术展示了Vsx2神经元在胸椎中的分布特征。比较了Vsx2ON神经元的分布和连接组。结果发现 Vsx2ON 神经元占中胸脊髓神经元的 5.9%，对中胸椎 Vsx2ON 神经元的追踪显示，在腰椎脊髓中存在预期的密集投射。
图5
接下来，作者验证了中胸段脊髓中的Vsx2ON神经元是否可以分为具有局部投射和长程投射的亚群。在脊髓中，通过Zfhx3的表达来区分具有局部投射和长程投射的神经元。结果表明，Zfhx3和Vsx2仅在投射到这个区域的神经元（SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰髓）中colocalized（图6B）。对局部和长程投射Vsx2ON神经元的定量分析表明，这两种亚群在中胸段脊髓中几乎均匀分布。这些发现证实了嵌入中胸段脊髓的Vsx2ON神经元中，有一部分同时表达Zfhx3并投射到腰髓。
图6
作者推测，SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰髓神经元必须从参与SCI后行走恢复的关键超脊髓神经元直接接收投射。为了揭示这个连接特征，作者用AAV5-CMV-tRFP病毒标记vGi神经元，在中胸段脊髓中标记Vsx2和vGlut2突触小体（图6C）。结合组织透明化技术观察到，位于中胸段脊髓的SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰髓神经元从vGi神经元接收投射，并且这种投射模式在自然恢复后得到维持（图7，F和G）。
图7
这些结果表明，在中胸段脊髓中的各种神经元亚群中，SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰髓神经元不仅在自然恢复过程中最显著的转录改变神经元亚群，而且还表现出将超脊髓命令从SCI后瘫痪传递到腰髓的相关解剖学特征。3. 在完全 SCI 后，轴突再生到其自然目标区域
之前的研究发现，在发育期间提供支持轴突生长的关键因素可以促进SCI后解剖结构完整的脊髓再生为位于损伤下方一个节段的活神经组织，但这种再生并不能恢复行走。基于以上的发现，作者提出假设，SCI后恢复行走可以通过重新建立参与SCI后恢复行走的神经元亚群的天然投射模式来实现。因此，作者试图确定SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰髓神经元是否可以再生，以达到它们自然的目标区域。
为了测试这个可能性，作者调整了之前建立的重生策略，该策略利用了三种发育机制。首先，通过病毒过表达骨形态发生蛋白（Spp1）、胰岛素样生长因子1（Igf1）和角质源性生长因子（Cntf）（AAV-OIC）来恢复SCI上方的神经元的内在生长能力。其次，通过在损伤时延迟释放成纤维细胞生长因子2（FGF2）和表皮生长因子（EGF）来诱导形成支持轴突生长的基质。最后，在损伤下方作为化学吸引剂输送神经元源性生长因子（GDNF）的生物材料储库。
经组织透明化成像后，得到与之前观察一致的结果，受刺激、支持和化学吸引的轴突会穿过星形胶质细胞边界，穿过纤维化瘢痕，并在完全性 SCI 损伤后再生到有活力的神经组织中。这证明适当的趋化梯度能以类似发育的方式引导定向长距离轴突再生到其自然目标区域。这些结果表明，SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰髓神经元可以被工程化以在腰髓脊髓中生长出功能性的轴突。
图8
4. 解剖学上完全性 SCI 后行走能力的实质性恢复
因为作者通过化学吸引并指导参与自然恢复的分子定义的神经元亚群来再生到它们自然的目标区域，作者预计这种策略可能会在完全瘫痪后恢复行走。因此，作者在五个分别接受完全SCI并接受再生策略的鼠群中进行了长期全身运动定量。在8周的最终评估中，六只小鼠中有五只显示出与不完全SCI后小鼠类似的运动模式（图9，A至D）。作者在Vsx2Cre小鼠的胸髓中表达溶菌酶毒素受体（DTR），8周后，所有接受作者的再生策略的小鼠都恢复了与不完全SCI后恢复行走相似的步伐（图9，F至H）。给予溶菌酶毒素使所有受试小鼠瘫痪（图9，F至H）。作者在小鼠恢复行走能力后，测试了来自SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰髓神经元的投射到腰髓的作用。这些小鼠都表现出预期的行走恢复。给予CNO后，所有受试小鼠的行走能力立即受损，导致步态类似于未进行再生的小鼠（图9，J至L）。这些发现证实了再生并稳定的SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰髓神经元将它们的投射到腰髓的自然目标区域，对于完全SCI后行走的显著恢复至关重要。
图9
在这项研究中，作者研究了在解剖学完全脊髓损伤后恢复功能需要多大程度地针对特定神经元并再生这些神经元的轴突，不仅简单地跨过损伤，还要引导它们到达自然目标区域。作者通过联合病毒标记手段，结合组织透明化技术与光片大组织成像技术，追踪了部分胸部神经元的连接特征，发现它们的自然投射模式延伸到尾部几个节段，结合多途径再生策略，实现了神经元轴突穿过纤维化病变区域的三维可视化观察，这一理解对设计用于大型哺乳动物和人类的疗法具有重要意义，因为再生轴突可能需要具有复杂的空间和时间特征的策略。
