重大研究突破 - 神经环路示踪与组织透明化技术结合，助力神经科学研究！
2024-05-10 16:09:42
佳维斯生物
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人类大脑内含约一千亿个神经元，它们之间通过约一千万亿个突触连接相互联系，形成了几乎无限数量的神经环路。这些环路是支撑各种基本和高级脑功能的结构基础。深入了解神经环路对于理解大脑功能原理以及神经系统疾病发病机制至关重要。在神经环路中，我们可以通过基因表达谱、生理学和形态学对神经元进行更精细的分类。基因表达谱揭示了一个细胞的特性，而其突触连接则定义了另一个维度。举例来说，即使两个神经元具有相似的基因表达谱，由于其不同的突触连接（涉及多样的神经环路和网络），它们仍然具有不同的功能和特征。因此，在大脑中不存在两个完全相同的个体神经元。神经元通过树突脊（突触后结构）从上游神经元接收信息，并通过轴突末端（突触前结构）向下游神经元发送信号。每个神经元的直接上游和下游合作伙伴数量差异很大，从几百到十万个不等，并且神经元信息可以通过单突触或多突触连接的汇合或分化的神经途径传输。神经示踪技术可以绘制这些神经元之间的连接方式。通常，顺行示踪剂会通过顺轴浆运输从细胞体到达投射的下游区域，而逆行示踪剂则可以通过逆轴浆运输从轴突末梢移动到细胞体。利用病毒传播的自然特性，越来越多的病毒被改造用于神经环路的示踪，从而极大地促进了对大脑神经环路和特异性神经投射网络的研究。
近期发表在《Neuron》上的综述文章，题为“Viral Vectors for Neural Circuit Mapping and Recent Advances in Trans-synaptic Anterograde Tracers”介绍了用于神经环路研究的顺行示踪剂和逆行示踪剂，描述了用于神经科学研究的特定病毒载体，并详细介绍了病毒载体在轴突示踪和跨突触示踪方面的应用进展。
1. 神经环路研究的传统示踪剂
自20世纪50年代起，神经解剖学示踪方法从依赖于基于损伤的轴突变性，逐步演变为化学示踪剂时代。传统示踪剂如放射标记的氨基酸和2-脱氧葡萄糖，以及逆行和顺行示踪剂如辣根过氧化物酶、霍乱毒素β亚单位、生物素化葡聚糖胺等，虽然能绘制全局连接，但无法揭示分子级别的细胞类型连接或轴突与特定细胞之间的突触联系。相反，病毒工具能通过基因策略定位到特定细胞类型，提供更精确的示踪和映射。这些技术的进步推动了在现代神经科学研究中广泛应用病毒-遗传方法，逐渐取代传统的化学示踪剂。
2. 神经环路示踪的工具病毒
病毒是一种小型传染性生物体，能够感染生物体的活细胞并在其中复制。病毒颗粒由核酸和蛋白质组成，其中核酸被包裹在一层被称为外壳的蛋白质保护层中。病毒依赖于与宿主细胞表面受体的相互作用，以选择性地感染特定组织。通过病毒伪装等策略，可以改变病毒的亲病毒性和运输特性。病毒根据核酸类别、是否有包膜以及基因组复制方式等特征进行分类。神经科学中的病毒工具提供了更精确的示踪和映射，通过基因策略可以将病毒定位到特定细胞类型，以提高转导效率并扩展或限制其亲病毒性。神经科学研究中使用的病毒通常是野生型病毒的基因修饰或重组菌株，包括腺相关病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒和假性狂犬病病毒、 lentivirus和其他逆转录病毒、森林塞姆利基病毒和森林塞姆利基森林病毒、狂犬病病毒和足膜病毒、天花病毒和杆状病毒。目前在神经科学研究中使用的所有狂犬病病毒示踪剂都来源于实验室衰减菌株。在美国和其他国家，这些病毒试剂可以根据BSL-2指南进行研究，无论是否进行基因修饰。然而，对于野生型菌株（从狗或野生动物中分离的狂犬病病毒），可能需要更高的BSL条件。
图1 按病毒基因组、病毒结构、基因表达及复制模式区分的不同类型的动物病毒
3. 用于细胞标记和基因传递的病毒载体
3.1 腺相关病毒 (AAV)
腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）是具有大约5 kb碱基对的单链正义链DNA基因组。AAV病毒颗粒小（约20纳米），天然不具备复制能力。从野生型AAV发展而来的重组AAV（rAAV）是生物医学中最常用的病毒工具之一。它是迄今为止发现的最简单的一种缺陷型复制病毒，由于其广泛的亲病毒性、相对长期的在非分裂细胞（包括神经元）中的表达以及在动物模型中的非致病性而被广泛用于神经科学研究中。不同于野生型AAV，rAAV载体的基因组通常不会整合到宿主DNA中，而是主要以环状形式，即表粒体，在转导细胞的细胞核中维持，外壳蛋白容易修改以适用于不同的细胞类型。rAAV经常与Cre/loxP和flippase（Flp）/flippase识别目标（FRT）重组酶技术结合使用，这些技术通常适用于所有DNA病毒。rAAV不仅具有优秀的安全性，而且继承了野生型AAV的许多优点，例如低免疫原性、多种血清型、广泛感染的宿主细胞范围以及在体内介导外源基因长期稳定表达的能力。唯一缺点是其较小的转基因容量（约4.8 kb）。在神经科学领域中，不同的AAV血清型表现出不同的趋化性，可以在体内和体外转导神经细胞。由于感染rAAV的宿主细胞无法产生新的病毒颗粒，rAAV在神经元之间不能有效地进行跨突触传播。AAV的前行、后行和双向运输特性取决于血清型和浓度。因此，研究人员选择适当的AAV血清型非常重要。一般来说，大多数AAV血清型倾向于进入注射部位神经元的细胞体，随后的细胞转运可能导致转基因产物在整个神经元中的扩散。
3.2 伪狂犬病病毒（PRV）
伪狂犬病病毒(PRV)是α-疱疹病毒亚科的成员，直径为200-250纳米，基因组约150 kb，为球形双链DNA病毒，有包膜，可插入大型外源基因。其菌株包括Becker和Bartha，Bartha菌株毒性较小，逆行传播能力强，被广泛用于神经环路研究。重组PRV如PRV531和PRV724具有强大的荧光标记，可有效用作逆行跨多突触示踪剂。针对特定神经元的逆行传播的PRV如Ba2001已被开发，有助于精确阐明神经环路。重组PRV Ba2017和PRV-hSyn-Cre被设计用于靶向基因表达，促进体内神经环路的功能解剖。优点包括在神经环路研究中的广泛应用，缺点可能包括感染人类中枢神经系统并引发脑炎的风险，因此在病毒修改和应用中需要强调个人保护。
3.3 狂犬病病毒（RV）
狂犬病病毒（RV）是一种包膜的负链单链RNA病毒，直径约为75纳米，长度为180纳米，呈弹头形状，基因组大小约为12 kb。RV具有高度神经亲和性，其复制通过自编码的RNA聚合酶复合物完成。野生型狂犬病病毒 (WT RV) 是狂犬病的主要致病因子，通常通过感染的狗的咬伤传播。RV-ΔG是一种经过基因改造的狂犬病病毒，它的包膜糖蛋白基因被删除，常用作神经科学研究的跟踪工具。它可以定向感染特定的神经元，或者通过直接注射到神经元中进行单一突触追踪研究。为了确保特异性，RV-ΔG与伪装的EnvA配合使用，只有表达鸟类病毒受体（TVA）的细胞可以被感染。这种改造使RV-ΔG成为一种复制缺陷病毒，因此无法自然传播到其他神经元，除非提供糖蛋白 (G)。RV-ΔG的逆行跨突触感染效率相对较低，而且毒性较高，这使得其在一些研究中的应用受到限制。为了提高逆行跨突触效率，同时降低毒性，研究人员开发了一些改良方法。例如，CVS-N2c菌株经过修改后，逆行跨突触能力更强，毒性更低，但制备困难，且滴度较低，限制了其广泛应用。为了进一步提升效率，科学家设计了经过密码子优化的嵌合糖蛋白 (oG)，提高了逆行跨突触的效率。尽管如此，这种改进还没有广泛应用。重组后的oG（ooG）可使追踪效率提高10倍，但研究仍在继续，以寻求更高效且低毒的追踪系统。
3.4 HSV1株H129
HSV1株H129最初是从患有急性HSV脑炎的患者的大脑中分离出来的，因其具有顺行跨突触传播的特性而被广泛用作输出网络示踪剂。通过复制能力强的、跨多突触的H129追踪到的神经网络可能来自两种类型的启动细胞。一种是注射部位附近的神经元（真实启动位点），另一种是逆行感染的神经元（异位启动位点），在这些神经元中，H129可以复制并通过它们的轴突侧支顺行传播。但其在神经环路示踪中存在标记亮度低和非特异性逆行标记的问题，并因其具有毒性，导致动物会在感染后3-5天内死亡，且需要进行免疫染色来放大荧光信号以可视化输出神经环路。
3.5 水疱性口炎病毒（VSV）
水疱性口炎病毒（VSV）是一种形如子弹的包膜负链RNA病毒，属于家族Rhabdoviridae中的Vesiculovirus属。其基因组约11 kb，包含核壳蛋白（N蛋白）、磷蛋白（P蛋白）、基质蛋白（M蛋白）、G蛋白和大聚合酶（L）的基因。G蛋白使VSV能够感染大多数哺乳动物细胞，而N蛋白则包裹RNA基因组形成核壳。其具有其快速复制、高效感染和基因表达能力，适用于对神经网络进行顺行递归跟踪。它能够在神经元之间进行顺行传播，并且可以通过假装其G蛋白与其他病毒的糖蛋白进行不同标记特性和突触传递类型的伪型化。
然而，VSV在实验动物中的高毒性和快速致死性限制了其在神经环路结构和功能长期研究中的应用。为解决这一问题，开发了一种突变型的VSV（VSV-NR7A），其细胞毒性减弱，顺行传递能力增强。此外，为了区分单突触和多突触连接，一种缺乏糖蛋白基因的VSV（VSV-ΔG）通过提供复制无能的依赖于Cre的方式标记直接连接的神经元，从而实现了精确标记。
3.6 慢病毒（LV）
慢病毒（LV）是Retroviridae家族的成员，是球形的包膜病毒，直径约80-100纳米。其基因组为单链RNA，包含gag、pol和env基因，分别编码衣壳的多蛋白组分、反转录酶、蛋白酶、整合酶和包膜糖蛋白。病毒RNA基因组经反转录转变为DNA，以整合到宿主基因组中。基于人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的LV载体是神经科学研究中最广泛使用的，能够稳定高效地在体内将基因转移至成熟神经元，并感染分裂和非分裂细胞，包括成年哺乳动物大脑中的神经元和神经胶质细胞。它们的包装能力高达9 kb，因此成为基因治疗的理想载体，特别是用于治疗神经系统和神经退行性疾病。LV载体的靶向性主要由病毒包膜糖蛋白决定，这对载体的转导至关重要。LV载体通常使用多种糖蛋白伪型化，典型的是来自VSV（VSV-G）和RV（RV-G）的包膜糖蛋白。使用VSV-G包装的慢病毒载体可以通过前行运输将表达的蛋白转导至神经元的细胞体和轴突，并具有低效的逆行基因转移。然而，伪型化为RV-G的LV载体显示出改善的逆行轴突运输。此外，伪型化为融合包膜糖蛋白B型（FuG-B）的LV载体展现出高效的逆行转运（HiRet），而伪型化为融合糖蛋白C型（FuG-C）的LV载体表现出神经元特异性逆行基因转移（NeuRet）。这些病毒载体已被应用于靶向注射部位的神经元群体，因此可用作解剖学映射和特定投射通路功能分析的逆行示踪剂。
3.7 犬腺病毒2（CAV-2）
犬腺病毒包括两种主要血清型，CAV-1和CAV-2，它们在基因上有着明显的差异。CAV-1是导致传染性犬肝炎的致病原，而CAV-2则是导致传染性犬呼吸道疾病的致病原。CAV-2是一种腺病毒，是一种非包膜的双链DNA病毒。由于其相对低的免疫原性、对神经元的优先转导、哺乳动物大脑中长期转基因表达以及从轴突端到细胞体的高效逆行运输等优点，它已被广泛用于神经科学研究中。其逆行传播特性依赖于柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR），CAR是负责CAV结合、内化和轴突运输的细胞粘附分子。由于CAR在成熟神经元中表达，并位于细胞体和突触的位置，因此CAV-2不仅可以在注射部位转导神经元，还可以转导从注射部位向内延伸的投射神经元，通过逆行机制从轴突端到达远处的细胞体，驱动基因表达。因此，它可用于基于神经元投射的定向靶向。将CAV-2表达Cre重组酶的载体与另一个载体结合，后者包含Cre诱导表达的效应子，可用于监测或干扰一个脑区投射到远端区域的神经元。例如，使用逆行的CAV2-Cre和前行的AAV可以实现CAV-2从远端轴突端逆行传输回细胞体并在核内表达Cre重组酶，然后激活AAV携带的效应子在从AAV注射部位投射到CAV-2注射部位的神经元中的选择性表达。这种双病毒策略特别适用于研究相互的神经通路。此外，CAV具有较高的携带能力，适用于神经环路的精细解剖。CAV的大携带负载允许将多种基因（如光遗传学元件、神经活动指示剂、大型启动子和重组酶）装载到一个CAV载体中。这可用于以细胞类型和/或投射特异性方式选择性地标记神经元，从而同时实现对神经活动的监测和操纵。
表1. 神经科学应用中常用病毒工具（部分）
表2. 神经科学应用中常用病毒工具（部分）
4. 病毒的顺行示踪和逆行示踪
顺行示踪剂和逆行示踪剂是用于神经标记的两种不同类型的病毒示踪剂。逆行病毒示踪剂包括逆行运输病毒和逆行跨神经元或跨突触病毒。用于标记投射细胞类型的病毒称为逆行运输病毒。这些病毒通过轴突末梢进入，通过动力蛋白复合物（dynein）逆行运输效率高地被运送回到细胞体，然后被释放出来。这些病毒包括CAV2、特定的AAV亚型（称为rAAV2-retro）等。以逆行方式从神经元传播的病毒被称为逆行跨神经元或跨突触病毒。这些病毒通常包括狂犬病毒、VSV、HSV1和PRV，它们具有穿越多突触途径的能力，并且具有复制能力，从而在过程中的每一步放大信号。
图2 逆行运输病毒标记细胞类型的策略
与逆行病毒示踪剂相反，顺行病毒示踪剂包括用于神经元轴突标记的病毒以及用于神经元之间顺行传播的病毒（称为顺行跨神经元或跨突触病毒）。rAAVs可能是许多神经科学家用于顺行轴突标记的首选。艾伦小鼠脑连接图谱项目，旨在在整个小鼠脑的数百个部位绘制神经连接，就是基于AAV载体的通路示踪。
图3 非跨突触（静态）和跨突触（跨多突触或单突触）病毒工具的顺行或逆行传播示意图。（来源：Viral Tools for Neural Circuit Tracing.）
而很少有病毒载体仅表现出顺行跨突触标记的特性。野生型的HSV和PRV均具有顺行和逆行跨突触的特点。相比之下，最常用的顺行跨突触病毒是疱疹病毒H129株的HSV1，能优先进行顺行的跨突触传播。其次是VSV病毒用于顺行投射的跨突触研究。
图4 逆行单突触狂犬病病毒追踪和顺行单纯疱疹病毒（H129）追踪的特定环路映射应用
目前顺行示踪剂的荧光标记较弱，无法描绘出神经元的细节特点。H129株的HSV1被认为是最有应用前景的顺行神经元示踪工具。H129是从病毒性脑膜炎的患者中分离出来的，可以帮助确定神经元间的单突触连接，并在啮齿类动物和非人灵长类动物中发现均具有良好的顺行示踪效果。但是H129具有较高的细胞毒性，在进行跨多突触示踪的时候，感染H129的小鼠会在3-7天内死亡，并因其具有高度传染性和致命性，在动物模型中的应用受到限制。
图5 H129-G4进行顺行示踪标记神经元的细节特征
因此使用H129可能需要特殊的生物安全措施，以避免对实验动物和研究人员造成危险。最近开发出来的H129-G4能增强荧光表达信号，无需额外免疫染色的情况下，即可清楚地标记神经元的树突、脊突和轴突纤维等细节特征。另一种改良后的 H129-ΔgK 在H129荧光强度的基础上降低毒性，有望成为更佳的顺行跨突触标记病毒。选择合适的示踪剂/示踪病毒高效完成神经标记是探究神经环路研究的基础。接下来需要光学成像技术来检测整个环路的投射情况。传统组织切片的研究方法能够对投射区域内神经元信号进行精确脑区定位，但是二维切片层面的信息无法完整呈现神经纤维的传递投射。近年来，组织透明化技术快速发展，通过均衡不同细胞成分之间的折射率和去除色素来减少生物组织中的光衰减，从而提高成像深度，为厚组织甚至整个生物体的三维成像提供有效工具。
应用案例：
一、外周神经环路三维可视化
哺乳动物的脂肪组织是受到神经支配的，这种神经支配主要是通过交感神经来维持的，在调节棕色和白色脂肪的产热和脂质代谢中发挥着重要作用。最近，斯克里普斯研究所叶立教授的研究表明大脑可通过感觉神经元主动获取脂肪组织中的信息。该研究中，研究人员首先在小鼠脊髓背根神经节（DRG）处注射荧光标记的AAV病毒，病毒顺行传递示踪标记下游神经，结合组织透明化和光片显微成像技术，更好地追踪感觉神经元延伸入脂肪组织的通路；同时在脂肪组织内注射CTB染料，CTB染料逆行传递到DRG中，进一步证明感觉神经元支配脂肪组织。利用这项技术发现，接近半数的神经元没有与交感神经系统相连，而是与背根神经节连接。
二、中枢神经环路三维可视化
味觉系统识别味觉物质（味道）的能力使动物能够识别和区分不同的基本味觉品质。本研究中，科学家们研究了小鼠如何获得甜味和苦味的价值与特性。科学家们运用病毒示踪技术，在甜味反应皮层（GCsw）和苦味反应皮层（GCbt）分别注射AAV-eGFP和AAV-tdtomato病毒，结合组织透明化和光片显微成像系统，发现甜味反应皮层和苦味反应皮层中的神经元会投射到杏仁核中不同区域，传递开胃和厌恶味觉信号的神经投射有很强的分离性。
三、外周--中枢神经环路三维可视化
哺乳动物的运动行为离不开骨骼肌的支撑，骨骼肌功能的完成受脊髓内下运动神经元和脑内上运动神经元支配。在本研究中，将伪狂犬病毒PRV152-EGFP 注射入屈指浅肌，病毒从外周骨骼肌内逆向传递到脊髓内下运动神经元，并完成跨突触传递，点亮脑内上运动神经元，随后利用FDISCO透明化方法和光片显微镜，对大脑中调节骨骼肌运动功能的功能连接神经元进行成像。结果发现支配屈指浅肌得到神经元主要分布在脑干、下丘脑和初级运动皮层。
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佳维斯最新一代透明方法及全脑配准分析示意图
基于AAV病毒标记的全脑神经三维透明成像