活体颅骨光透明技术在光学成像中的应用

 活体脑成像对于研究大脑生理病理活动有着至关重要的意义。现代光学成像技术侵入性低、分辨率高，因而能够用于活体观测生物结构和功能，在脑科学领域发挥着重要作用。但是，在活体状态下，大脑表面的颅骨对光的强散射严重限制了光的穿透深度，进而影响了皮层成像的深度和质量。为了克服颅骨的散射，以往的研究往往需要在成像前建立各类手术颅窗，主要包括开颅玻璃窗、磨薄颅骨窗以及它们的变体。开颅玻璃窗虽然可用于动物脑部成像，但是，开颅手术容易导致炎症反应及氧化应激反应，进而开颅后3天逐渐形成白色絮状物影响后续成像效果，且往往会持续约 2周，因此并不适合急性模型（3天以内）的观测及长期（2周以上）活体成像监测。磨薄颅骨窗的建立通过将部分颅骨磨薄至约 25 μm左右，从而实现对皮层的活体高分辨观测。但磨薄颅骨窗不适用于大视场观测皮层，因为将大面积的颅骨均匀地磨薄至25 μm的难度非常大。另外，颅骨被磨薄后会重新生长，并且新生的颅骨易碎，难以实现多次的重复打磨。所以，磨薄颅骨窗不适用于长期反复跟踪观测。

 近些年兴起的组织光透明技术可以降低生物组织的散射，增强光在组织中的穿透能力，已被广泛应用于离体大组织甚至全器官三维高分辨成像。不仅如此，组织光透明技术在活体水平也得到了很好的应用。研究人员发展的活体颅骨光透明技术，以及基于此建立的光透明颅窗，可以在不进行开颅手术的情况下，结合多种现代光学成像手段，实现大脑皮层的神经血管结构和功能的无创成像观测。针对不同的应用场景，开发了不同的光透明颅窗，可以分别满足高分辨、大视场、长时程观测等要求。相比于开颅玻璃窗，光透明颅窗可以避免手术带来的炎症反应等副作用，从而适用于急性观测；而相比于磨薄颅骨窗，光透明颅窗可以通过反复建立而观测数月，从而实现长期跟踪监测。

目前的活体颅骨光透明方法包括以下几种：（1）用于提升皮层血管成像质量的颅骨光透明方法（SOCS）[1]；（2）用于实现神经树突棘分辨的颅骨光透明方法（SOCW）[2]；（3）大视场、可重复性颅骨光透明方法（USOCA）[3]；（4）可见-近红外兼容的光透明方法（VNSOCA）[4]；（5）用于长期观测的颅骨光透明方法（TIS）[5]。本文主要介绍活体颅骨光透明技术在光学成像中的应用。

（1）激光散斑衬比/高光谱成像

血流和血氧变化是反应血管功能的重要指标，监测皮层血流、血氧信息对于研究多种脑疾病有着重要的意义。激光散斑衬比成像是一种非标记的、高时空分辨的血流分布成像技术；高光谱成像技术是一种非标记的血氧分布成像技术。颅骨光透明技术的出现使其得以在完整颅骨下获取皮层血流及血氧信息。

图1. 重复光透明成像用于皮层血流和血氧监测[3]。（a）颅骨短期重复透明成像；

（b）颅骨长期重复透明成像。

      利用颅骨光透明技术，可以持续一周地每天对小鼠进行颅骨透明化操作并获取血流血氧信息（图1. a）。不仅如此，研究人员对 2 月龄的小鼠进行了每月一次、为期 5个月的持续成像，并成功观察到皮层血管网的动态变化，即部分血管的消失和新生（图1. b）。除了对单侧颅骨进行透明外，研究人员还对小鼠双侧颅骨进行光透明处理，用于监测大脑中动脉阻塞（MCAO）后双侧皮层血流及血氧变化（图2）。

图2. 光透明颅窗用于监测MCAO引起的皮层血流动力学变化[3]。（a）MCAO前后双侧皮层血流及血氧变化；（b-c）皮层血流及血氧变化柱状图。

（2）光声成像

光声成像是近十年来出现的一种基于激光超声的生物医学成像新方法。它是一种混合成像方式，结合了光学成像的高对比度和基于光谱的特异性以及超声成像的高穿透深度，克服了传统医学成像手段的不足。然而，由于颅骨的存在，光声成像在大脑中的应用受到了阻碍。颅骨光透明技术可以通过降低光学散射特性来改善光进入深层组织的传输。研究人员发现，颅骨光透明技术可以抑制浑浊颅骨所引入的激光和刺激超声的衰减和失真，增加光声成像的光学分辨率（OR）和声学分辨率（AR），而且光声显微镜用于大脑微血管成像的性能提高（图3）。该技术为解决光声成像中颅骨受限问题提供了一种简便易行的方法，对神经血管学研究具有重要意义。

图3. 光透明颅窗结合光声成像观察皮层血管结构[6]。(a) 未处理颅骨的反射图像；(b) 颅骨光透明后颅骨的反射图像；(c) 完整颅骨的光声成像；(d) 颅骨光透明后的光声成像；

(e) 图(c)和(d)中绿色箭头所示同一血管的光声信号；(f) 颅骨光透明处理前后光声信号

振幅和血管直径的统计分析。

（3）受激拉曼成像

受激拉曼散射成像是一种新型的相干拉曼散射成像技术，利用基于分子振动特征的化学特异性，可以实现无标记生物成像，展现出了无标记、快速、高灵敏度、高特异性等优势。研究人员通过受激拉曼成像分析了颅骨光透明过程中颅骨的主要成分---胶原蛋白和羟基磷灰石（钙质）的变化，对颅骨光透明技术的作用机制进行了分析。研究发现活体颅骨光透明的基本原理是（部分）去除颅骨中的钙质、脂质和蛋白质，并使用折射率匹配试剂进一步提高透明效果（图4）。该研究为未来活体光透明方法的发展提供了理论依据，可以用于筛选更高效的活体颅骨及其他组织光透明方法。

图4. 受激拉曼成像揭示颅骨光透明技术的机制[7]。（a-c）幼年小鼠顶骨中胶原纤维和羟基磷灰石显微结构图像。颅骨未处理（a），10 %胶原酶处理（b），10 % EDTA处理（c）。

（d-f）成年小鼠顶骨中胶原纤维和羟基磷灰石的微观结构变化。颅骨未处理（d）， USOCA处理（e），10 % EDTA处理（f）。

（4）双光子/三光子成像

与其它光学活体成像相比，双光子/三光子成像具有较高的空间分辨率，可实现细胞与亚细胞分辨水平的结构成像研究，已经成为神经科学领域一项有力的研究工具。一般来说，双光子/三光子应用于神经科学研究时需要配合开颅玻璃窗或者磨薄颅骨窗，而活体颅骨光透明技术的发展为其应用提供了一种新型的非侵入式的观测思路。

图5. 光透明颅窗结合双光子成像监测皮层树突棘可塑性[2]。

研究人员借助光透明颅窗，成功实现了神经元突触可塑性的观测。在建立光透明颅窗后，双光子成像获取的神经信号的图像质量得到显著改善，足以对树突棘进行清晰地成像。随后对小鼠神经元树突棘进行持续观测，观察树突棘的出现和消失、以及形状的变化（图5）。除了高分辨率成像外，颅骨光透明技术通过在颅骨表面滴加化学试剂使颅骨透明，因此可以用于大视场的透明成像。如图6所示，研究人员可以对小鼠颅骨顶部进行大范围透明处理，进而通过双光子成像对皮层血管和神经进行大视野和高分辨成像。

图6. 光透明颅窗结合双光子用于大视场、高分辨成像[5]。

常规的活体颅骨光透明技术在光透明颅窗建立过程中需要先将小鼠麻醉，然后使用化学试剂进行处理，而且成像过程中液体的化学试剂需要保持在颅骨表面。但是纯粹的液体试剂无法应用于清醒或自由活动的小鼠皮层的观测。而最新发展的长效光透明技术，光透明颅窗在建立后可以在小鼠颅骨上维持数周，从而可以满足对清醒动物进行成像的需求。借助于这种长效光透明技术，研究人员在光透明颅窗建立后2周内对清醒小鼠的神经活动进行了观测。在2周的观测期间内，神经元的双光子成像效果保持良好，可以清晰地通过钙信号变化观察神经元活性。

图7. 光透明颅窗透明效果的长期保持（a）及用于清醒动物钙信号成像（b）[5]。

与双光子成像技术相比，三光子成像技术拥有更高的空间分辨率。此外，由于三光子荧光与三次谐波发光所用的激发波长相较于双光子更长，因此具有更大的成像深度。这些特征使三光子成像在深层组织和高分辨生物成像领域具有重要的应用前景。而活体颅骨光透明技术同样可以用于三光子成像。经过颅骨光透明作用后，三光子成像获取的皮层血管三次谐波信号得到显著增加，而且皮层神经元成像的深度和对比度都得到显著提升（图8），这为脑皮层深层信号的获取提供了有力的手段。

图8. 光透明颅窗用于三光子成像[4, 5]。（a-c）颅骨光透明作用前后皮层血管白光图（a）、三次谐波信号（b）、神经元信号三维重构（c）。

（5）光操控

      现代光学技术不仅可以获得高分辨率的神经血管图像，而且可以对大脑皮层进行操控或建立特定的模型。基于颅骨光透明技术的窗口，也可替代开颅窗和磨薄窗，用于皮层光操控。比如，结合光透明颅窗和光动力效应，既可以打开血脑屏障，也可以建立靶向缺血性脑卒中模型；此外，透过光透明颅窗，将飞秒激光聚焦在血管上，可以实现对单根血管的烧蚀，从而建立局部靶向的出血性脑卒中模型。

研究人员利用光透明颅窗，在不开颅的情况下实现了光动力效应打开血脑屏障，并可以在活体水平跟踪荧光染料的渗漏过程（图9. a），随后进一步研究了光动力效对于不同年龄小鼠血脑屏障功能影响的差异性。这些研究为脑药物递送和脑疾病的治疗提供了一种新的手段。此外，研究人员还将活体颅骨光透明技术与光栓技术相结合，在非开颅的情况下，实现了对大脑皮层血管的靶向栓塞。通过改变激光照射位置和照射剂量，可以对栓塞程度和栓塞区域进行调节（图9. b），该模型可以用于评估溶栓药物对不同尺寸血管的溶栓治疗效果。

图9. 颅骨光透明技术用于皮层光操控[8, 9]。（a）光透明颅窗结合光动力效应打开血脑

屏障；（b）光透明颅窗结合光动力效应实现光栓模型建立。

展望

       近年来发展的颅骨光透明技术为活体皮层观测提供了一个无需开颅的光学窗口。随着光透明颅窗的出现，光声成像、激光散斑成像、双光子/三光子成像、近红外二区成像、高光谱成像和非线性显微成像等多种光学成像技术被应用于活体观察皮层神经元、小胶质细胞等细胞及血管结构和功能。借助光透明颅窗，可以动态观测神经突触可塑性、神经元自发或对刺激的响应、长时程监测血管的修剪与新生、表层与深层的血液流速变化等[10, 11]。此外，光透明颅窗技术还有望与光学相干层析成像技术相结合，有潜力在无需标记的情况下获取皮层深组织的血管结构与功能信息。不仅如此，颅骨光透明技术也为皮层靶向光操控提供了非侵入性的窗口。利用飞秒激光，可以实现神经血管的靶向损伤；结合光动力效应，可以实现血脑屏障的开放或建立光栓模型。这也极大的拓展了颅骨光透明技术的应用场景，有望在多种病理模型的研究中发挥作用。

随着颅骨光透明技术的不断发展，至今已有多种光透明颅窗可供选择。而光透明颅窗发展至今，已同时具备了高分辨、大视场、长时程、适用于急性观测的优势，因而有望在某些传统颅窗无法胜任的场合（比如急性创伤性脑损伤的跨脑区观测，以及颅骨下方脑膜的结构与功能成像）提供重要的技术支撑，从而在未来的脑科学研究中大放异彩。

诚然，目前颅骨光透明技术依然有所限制。比如，对于更大动物的活体颅骨光透明方法并不完善。对于大鼠颅骨的活体透明需要先将颅骨磨薄，才能获得较好的透明效果，目前佳维斯团队正在先前小鼠颅骨透明技术基础上开发大鼠颅骨透明技术，相信不久以后这款新产品也即将推向市场并服务于广大科研工作者。而对于大型灵长类动物（如猕猴），尚未有适用的活体颅骨光透明方法。这需要研究人员继续探索更高效的颅骨光透明方法。未来更有效的颅骨光透明技术的出现，结合更多的成像方法（如大视场、高分辨且同时拥有大景深的光场显微成像技术），将会为脑科学的发展提供更有力的技术保障！

参考文献：

[1]Wang J, Zhang Y, Xu T H, et al. An innovative transparent cranial window based on skull optical clearing [J]. Laser Phys Lett, 2012, 9(6): 469-73.

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[9]Li D, Deng L, Hu Z, et al. Optical clearing imaging assisted evaluation of urokinase thrombolytic therapy on cerebral vessels with different sizes [J]. Biomed Opt Express, 2022, 13(6): 3243-58.

[10]Xu C. Optical clearing of the mouse skull [J]. Light, science & applications, 2022, 11(1): 284.

[11]Li D, Yu T, Zhu J, et al. In vivo Skull Optical Clearing Technique and its Applications (Invited) [J]. Acta Photonica Sinica, 2022, 51(8): 0851514.