活体光透明技术在活体神经血管成像中的应用

生物体是由复杂多样的细胞构成的，其结构与功能通常是作为一个整体表现出来的。在器官乃至全身水平上，高分辨地获取生物组织三维结构信息对诸多生物医学相关的研究至关重要，例如神经科学中大脑神经元连接信息的绘制、发育生物学中器官的形态发生等。

近年来兴起的组织光透明技术是利用化学或物理的原理与方法将大块组织或完整器官甚至活体动物透明化处理的技术，通过采用多种物理、化学的手段，减小组织对光的衰减，使得生物组织变得对光“透明”，从而提高了光学成像的成像深度与成像质量。该方法与多种荧光标记技术、光学成像技术的结合为高分辨获取组织器官的三维整体结构信息提供了重要的手段，弥补了传统机械切片显微成像技术的不足，在生命科学特别是神神经科学领域产生了巨大的影响，作为新兴起来的一种生物组织学技术，受到了越来越多科研人员的关注与青睐。                                                                                                      

图1：组织光透明方法的两大策略：减少光散射与光吸收

 最早见诸报道的组织光透明技术是德国科学家Werner Spalteholz用苯甲醇和水杨酸甲酯混合物“清除”心脏等大型器官。而最早尝试脑组织光透明的方法，可以追溯到2007年维也纳科技大学和德国马普研究所的研究者首次使用苯甲醇和苯甲酸芐酯的混合物（BABB）透明小鼠全脑，并绘制出3D小鼠脑神经网络。在此之后组织光透明技术迅猛发展，到如今已经有几十种组织光透明相关技术。

图2：不同离体组织透明方法发展历史

 正常的生物组织中成分复杂，如蛋白质、脂质和血红素等物质对光的传播造成阻碍。光透明技术使用一种试剂或几种试剂组成的混合液通过浸泡、电泳或灌注等处理方式,使大块组织或完整器官达到视觉下透明或光学仪器下可见的效果，简单来说就是让这些生物组织具有光学透明特性，利用这种技术实现透明的脑标本称为透明脑。Dodt等人在2007年首先完成了对出生后10天幼鼠全脑的透明，并命名为Murray透明法或BABB。Murray透明法的出现使得完整观察神经网络成为可能，并带动了现代组织透明技术的发展。这种技术的优势在于不破坏组织完整性的同时具有三维成像的能力。在此基础上，组织透明技术经诸多科研机构努力涌现出了多种具体方法,并不断完善和持续更新;最早实现透明的器官是脑，逐渐拓展至脊髓及其他器官;组织透明适用的物种也由起初的小鼠，逐渐扩展到大鼠、兔、非人灵长类动物乃至人类。

图3：大小鼠不同离体组织器官透明前后图

 完整的器官之所以不透明与其组成物质有关，组织中含有水、蛋白质、脂类等多种不同物质，各物质折光系数不尽相同,当光线通过这些不同组分时发生散射，并且组织或完整器官越厚散射越强透射越少，从而导致光学观察受到了限制。基于这一理论，现有的光透明技术的原理大致可分为两类：一类是去除折光系数差异较大的物质,选择性的去除组织器官中的某些物质可以减少折光系数间的差异。鉴于蛋白质是绝大多数生物医学研究的目标分子，所以需要使用脱水或脱脂的方法来实现组织透明，而且脱水或脱脂越彻底，组织透明效果越好。第二类主要是使用与组织折光系数相似的介质溶液利用浸泡或灌注的方式使组织器官透明。事实上随着光透明技术的不断发展，几乎没有一种透明方法单纯的使用一种透明原理，而是综合多种原理来实现组织透明。

图4：组织光透明原理

 由于研究的需要，许多时候需要在研究生物体存活时观察并监测体内活动，如在活体动物观察脑血管或脑神经。目前脑血管或脑神经的在体观察主要通过光学显微镜，此类光学仪器在要求分辨率的情况下无法实现较深层成像，其成像对比度和深度都受到限制。因此将光透明技术引入到活体组织观察脑血管或脑神经，在解决成像对比度和深度这两大关键问题方面具极大潜力。佳维斯（武汉）生物医药有限公司核心技术团队将活体光透明技术引入到激光血流成像和双光子显微成像的相关研究课题中，根据长期对该技术的研究和发展形成了活体颅骨光透明技术、活体皮肤光透明技术和活体硬组织光透明技术等活体光透明系列技术，可大大提高活体颅骨及皮肤成像深度与分辨率。

                                                                                       透明前颅骨                             透明后颅骨

     图5：颅骨透明试剂盒透明颅骨

 激光散斑血流成像技术能够实时直观地观察皮下血管结构并评估其功能，不仅是了解正常的活体器官生理，而且对观察各类疾病中微血管功能障碍进展与神经退行性变之间的关系也至关重要。其原理为观察目标受到激光束照射时，反射后的激光形成随机干扰图像（包括亮区和暗区），该图像称为激光散斑图。如果被测目标静止，激光散斑图也保持不变；如果被测物体发生移动，例如组织中的红细胞运动，则激光散斑图会随之波动。散斑变化速度以散斑对比度量化，而对比度与血流相关；这就是激光散斑血流成像技术用于血流流速变化和灌注量评估的工作原理。

 图6：激光血流成像法观察活体小鼠中动脉栓塞再释放过程中（MCAo）大脑皮层上血流分布的时空变化

       就像所有的光学成像技术一样，激光散斑血流成像技术也受限于成像深度，对皮肤表面的血管和血流能够成像，再深层就很难进行观察。引入活体光透明系列技术，不但可以提升激光散斑血流成像深度，而且提升了分辨率，以下的实验结果表明活体光透明后激光散斑血流成像的结果更清晰，背景更为“清澈”。

                                   (a)为小鼠耳朵图像，       (b)为透明化5min后耳朵图像，         (c)为10min后耳朵图像

                                                            (d)                                                                  (e)                                         

(d)为透明前颅骨下大脑激光散斑图，  (e)为透明后颅骨下大脑激光散斑图

   图7：耳朵和颅骨透明前后激光散斑图

       在很多动物实验中都需要开颅手术以进行相关的实验，活体颅骨光透明后无需开颅即可进行这些实验。目前完整颅骨是观察小鼠大脑皮下神经和血管的主要障碍，为了克服这一障碍，科研工作者们开发出几种类型的颅窗，包括磨薄颅窗、开颅手术和磨薄加固颅窗等。这些颅窗在某些情况下满足研究要求，但有局限性。例如，在颅骨窗变薄的情况下，很难进行大面积重复成像；开颅手术几乎不可避免地会导致皮质损伤和炎症；至于磨薄加固颅窗操作复杂且也会造成损伤。而活体组织光透明的应用解决了这些问题。通过在颅骨上进行组织光透明，可直接观测小鼠大脑皮下血管，不用对颅骨造成损伤。

图8：颅骨透明前无法观察到任何血管，颅骨透明15min后，肉眼可见大量皮质血管。在PBS清洗干燥后，头骨再次回复最初状态。再反复透明处理，还能观察到血管。最后在同一区域建立光学颅窗，与透明后效果类似。观察到的皮质血 管结构与通过光学透明颅窗观察到的相同，两种情况下都能清楚地区分大血管和微血管。

 如同激光散斑成像碰到“小鼠颅骨”的问题一样，在皮质上小鼠颅骨也阻碍了荧光标记的神经元结构和微血管的观察。同样，活体颅骨光透明技术也能辅助双光子显微镜进行更深层成像，无需颅窗手术“越过”颅骨成像观察大脑皮层结构。

                                             图9：活体颅骨光透明前后大脑皮层神经双光子成像

 根据以上结果可以明显发现，活体光透明处理后双光子成像的信号强度明显增强，且成像深度也大大提高。这些结果表明，光透明处理颅骨不仅提高了双光子显微镜的成像分辨率和对比度，而且还大幅提升了成像深度。

 活体颅骨光透明技术操作简单、安全有效，结合双光子显微镜或激光血流成像仪，能够反复观察脑皮层的微血管、神经元和小胶质细胞等。与现有的颅窗手术技术相比，无需对颅骨进行磨薄或移除，从而不会造成损伤。这种方法也被证明是安全的，几乎不会造成意外损伤或感染。由于不会造成炎症，此技术也更适合对微环境高度敏感的免疫细胞（胶质细胞）进行研究。因此，活体颅骨光透明技术无需对颅骨进行磨薄或切除，可以在大脑正常状态下观察皮层神经和血管网络结构与功能，且可以长期可逆透明成像观测。

                    图10：活体颅骨光透明技术是一种无损非侵入的颅窗透明方法，能够大幅度提升成像深度、透明后成像背景“清澈“从而提高成像质  量，透明的速度极快（仅需15分钟即可完成），最主要的特点：移除光透明剂后颅骨可再生，可进行多次重复成像。

       活体光透明技术作为一种新兴的活体成像样本制备技术，具有革命性的意义。在维持活体器官活性和完整性的同时具有光透明特征，不但广泛应用于活体激光血流成像的相关研究，在辅助双光子观察神经元和血管的应用方面及近红外成像等方面也具有广阔前景，可大大提高这些活体光学检测设备成像深度和分辨率。